Проверка ифнс по инн: Реестры и проверка контрагентов | ФНС России

выделяли из клеток с использованием Trireagent (Helena Biosciences, Сандерленд, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Количество и качество РНК оценивали путем определения OD ₂₆₀ и OD ₂₈₀ с использованием спектрофотометрии и дополнительной визуализации с помощью электрофореза в агарозном геле.

Профилирование экспрессии генов: анализ макромассивов

кДНК, меченная радиоактивным изотопом, была получена из 5–10 мкг тотальной РНК путем обратной транскрипции с помощью Superscript II (Life Technologies, Rockville, MD) в присутствии [ ³³ P] dCTP. Остаточную РНК гидролизовали щелочной обработкой при 70 ° C в течение 20 мин, и кДНК очищали с использованием колонок G-50 (Amersham Pharmacia, Bucks, UK). Перед гибридизацией с макромассивами меченую кДНК смешивали с 50 мкг COT-ДНК (Life Technologies) и 10 мкг поли (A) ДНК (Sigma-Aldrich), денатурировали при 95 ° C в течение 5 минут и гибридизовали в течение 1 часа. для минимизации неспецифического связывания.Подготовка макромассивов (представляющих 150 известных ISG), гибридизация радиоактивных кДНК, сканирование и анализ макромассивов проводились, как описано ранее (47).

Анализ защиты от РНКазы (RPA)

РПА (48). Зонды IP-10, IL-12Rβ2, iNOS, супрессор передачи сигналов цитокинов (SOCS) 1, SOCS3 и GAPDH были приобретены у BD PharMingen (Сан-Диего, Калифорния). Вкратце, зонды были синтезированы из транскрипционных векторов SP6 / T7 и помечены [ ³² P] UTP до 2–5 × 10 ⁸ импульсов в минуту на микрограмм входящей ДНК.Для анализа использовали аликвоты, эквивалентные 1–3 × 10 ⁵ импульсов в минуту каждого зонда и 5–10 мкг общей РНК. Интенсивность радиоактивных полос определяли количественно с использованием PhosphorImager (Storm; Molecular Dynamics, Саннивейл, Калифорния). Представляющие интерес полосы были количественно оценены, скорректированы на фон и нормализованы к контрольной полосе (то есть, GAPDH или γ-актину). Результаты выражаются в виде интенсивностей PhosphorImager.

IP-10 ELISA

DC культивировали в 96-луночных планшетах (1 × 10 ⁵ DC на 200 мкл) и обрабатывали подтипами IFN-α в течение 18 часов.Уровни белка IP-10 в супернатантах определяли с помощью специфического ELISA (HyCult Biotechnology, Норвуд, Массачусетс).

Результаты

Способность IFN подтипов IFN-α1, -α2 и -α21 активировать путь Jak / STAT и индуцировать значительный набор ISG была исследована на Т-клетках и DC. Эти подтипы были выбраны потому, что 1) IFN-α1 и -α2 обычно являются основными видами IFN, продуцируемыми в ответ на многие вирусы и поли (I: C) (49, 50, 51), 2) rIFN-α2 широко используется в терапевтических целях ( 4) и 3) IFN-α21 проявляет повышенную ингибирующую активность по сравнению с IFN-α2 (45).Кроме того, как рекомбинантный, так и природный IFN-α1 имеют в ~ 10 раз более низкую специфическую противовирусную активность, чем большинство подтипов, включая IFN-α2 и -α21 (52, 53). В соответствии с этим специфическая (противовирусная) активность используемых rIFN находилась в диапазоне 5 × 10 ⁷ и 5 × 10 ⁸ МЕ / мг белка для IFN-α1 по сравнению с -α2 и -α21, соответственно. В соответствии с существующей практикой везде указаны абсолютные концентрации подтипов. Для упрощения справки, абсолютные концентрации 2 нг / мл для IFN-α2 и -α21 и 20 нг / мл для IFN-α1 каждая соответствуют ~ 1000 МЕ / мл в зависимости от противовирусной активности.

Активация STAT в ответ на подтипы IFN-α

Человеческие Т-клетки и DC обрабатывали в течение 20 минут диапазоном концентраций различных подтипов IFN-α. Экстракты цельных клеток (фиг. 1⇓, A , верхние панели и C ) или иммунопреципитированные белки STAT2 ( A , нижние панели ) фракционировали с помощью SDS-PAGE, и фосфорилирование STAT было исследовали с помощью вестерн-блоттинга с антителами, специфичными для фосфорилированных остатков Tyr и / или Ser.Альтернативно, активированные димеры STAT подвергали аффинной очистке по их способности связываться с биотинилированным олигонуклеотидом, содержащим консенсусный элемент GAS, и связанные активированные STAT анализировали аналогичным образом (фиг. 1- B ).

Активация STAT подтипами IFN-α в Т-клетках и DC. Т-клетки ( A и B ) или DC ( C ) стимулировали различными концентрациями IFN-α1, IFN-α2 или IFN-α21 в течение 20 минут и получали лизаты цельных клеток. A и C , лизаты Т-клеток ( A ) и DC ( C ) разделяли с помощью SDS-PAGE, блотировали и исследовали на фосфорилирование STAT1 S727 и Y701 ( верхние панели ). Блот отделяли и повторно зондировали mAb против STAT1. Параллельно лизаты подвергали иммунопреципитации с помощью антител против STAT2 и иммуноблотировали с помощью антител против фосфотирозина (анти-P-Tyr), отделяли и повторно зондировали с помощью антител против STAT2 ( A , нижние панели ). B , лизаты Т-клеток очищали аффинно биотинилированным GAS-олигонуклеотидом (материал и методы ), подвергали электрофорезу, блоттингу и зондированию с помощью анти-STAT1, анти-STAT3, анти-STAT4 и анти-STAT5B Abs.Данные представляют как минимум два независимых эксперимента.

В Т-клетках мы наблюдали, что все три подтипа IFN-α индуцировали фосфорилирование тирозина STAT1 до -5 (рис. 1, A и B ). Однако фосфорилирование / активация этих STAT под действием IFN-α1 было сравнительно слабым: для детектируемого фосфорилирования тирозина для каждого из STAT требовались от 10 до 100 раз более высокие абсолютные концентрации этого подтипа (рис. 1⇑, A и ). B ).Аналогичным образом, для обнаружения положительного сигнала в менее чувствительном анализе фосфорилирования Ser ⁷²⁷ для STAT1 требовались от 10 до 100 раз более высокие концентрации подтипа IFN-α1 (рис. 1⇑ A ). Такое фосфорилирование не было обнаружено анализом экстракта целых клеток при любой из протестированных концентраций IFN-α1 (до 10 нг / мл; фиг. 1⇑ A ). Однако при более высоких концентрациях (20 и 200 нг / мл) фосфорилированные формы STAT1 Ser ⁷²⁷ можно было наблюдать в анализе GAS oligo pull-down.В этом анализе (рис. 1⇑ B ) две формы STAT1 с различной электрофоретической подвижностью представляют собой STAT1, фосфорилированный по тирозину (нижняя полоса , ), и STAT1, фосфорилированный как по тирозину, так и по серину ( верхняя полоса ) (46). Для IFN-α2 и IFN-α21 наблюдались сходные кривые доза-ответ для фосфорилирования как тирозина, так и серина, хотя IFN-α2 оказался немного более эффективным при более низких концентрациях.

В DC сравнение ответов на IFN-α1 и IFN-α2 аналогичным образом выявило большие количественные различия между этими подтипами в их способности индуцировать фосфорилирование тирозина и серина STAT1 (рис.1 C ) и STAT3 (данные не показаны) и индуцировать образование комплекса ISGF3, как определено с помощью EMSA (данные не показаны).

Также была исследована кинетика активации STAT в Т-клетках (рис. 2⇓ A ) и DC ( B ). Фосфорилирование STAT1 на Y701 поддерживалось в течение 1-2 часов, а затем снижалось. Учитывая количественно более низкую активность IFN-α1, не наблюдалось явных различий между подтипами IFN-α в кинетике фосфорилирования STAT1 Y701.Аналогичный анализ кинетики активации STAT2, -3 и -4 в Т-клетках и STAT3 в DC не выявил различий между подтипами IFN-α (данные не показаны).

Кинетика активации STAT1 в Т-клетках и ДК. Т-клетки ( A ) или DC ( B ) стимулировали различными концентрациями IFN-α1, IFN-α2 или IFN-α21 в течение различных периодов времени, как указано. Готовили лизаты цельных клеток и проводили иммуноблоттинг с антифосфо-Y701.Блоты удаляли и повторно зондировали mAb против STAT1. Данные представляют два независимых эксперимента.

Взятые вместе, результаты показывают, что существуют существенные количественные, но не качественные различия между подтипами IFN-α в отношении активации STAT как в Т-клетках, так и в DC.

Профилирование экспрессии генов

Индивидуальные макромассивы на основе кДНК, каждый из которых представляет 150 известных ISG в трех экземплярах ( Материалы и методы и Ref.47), были использованы в начальном скрининге дифференциальной экспрессии генов в ответ на три подтипа IFN-α. В предыдущих экспериментах для IFN-α2 в линиях клеток на основе HT1080 оптимальная индукция практически всех представленных ISG обычно наблюдалась при 2 нг / мл в течение 6-8 часов (47). Соответственно, в этом исследовании ответы на все три подтипа были проанализированы при 2 нг / мл, что соответствует физиологическим концентрациям ∼1000 МЕ / мл для IFN-α2 и IFN-α21 и 100 МЕ / мл для IFN-α1 (материалы ). и методы ).Чтобы компенсировать более низкую специфическую противовирусную активность, подтип IFN-α1 также исследовали в DC при более высокой абсолютной концентрации 20 нг / мл (1000 МЕ / мл). Была проанализирована общая РНК из необработанных и обработанных подтипом клеток. Результаты показаны как кратность индукции по сравнению с необработанными клетками. Данные для этих генов, индуцированных в 2 раза или более (27 в Т-клетках и 36 в DC), включая классические ISG MxA, 2′-5′-олигоаденилатсинтетазу и PKR , которые, как известно, участвуют в противовирусных ответах, представлены (Таблица I⇓).Как и ожидалось для ISG, не наблюдалось значительной репрессии (> 2-кратной) любого из представленных генов. Что касается активации STAT, как в Т-клетках, так и в DC, в целом, ISG сильнее индуцируются IFN-α2 и -α21, чем IFN-α1. И снова IFN-α21 был немного менее эффективным, чем IFN-α2 (Таблица I⇓). IFN-α1 в концентрации 2 нг / мл достаточно для активации STAT1 и -2 (рис. 1 и 2). В соответствии с этим, хотя и менее эффективен, чем IFN-α2 или -α21, IFN-α1 в концентрации 2 нг / мл явно индуцировал, особенно в DC, более высоко индуцибельный из спектра ISG, наблюдаемый с более сильными IFN-α2 и -α21. подтипы.То, что любое различие в значительной степени является количественным, было по существу подтверждено более близким соответствием, наблюдаемым при увеличении концентрации IFN-α1 с 2 до 20 нг / мл (таблица I, DC, , первая колонка ). Интересно, однако, что IFN α2 и α21 индуцировали экспрессию хемокина IP-10 и мРНК iNOS в DC, но не в T-клетках. Это является еще одним примером специфичности клеточного типа в ответе на IFN-α (47). Что еще более важно в этом исследовании, что касается специфичности подтипа IFN-α, не наблюдалось значительной индукции гена IP-10 в DC в ответ на IFN-α1, даже при повышенной концентрации 20 нг / мл, тогда как он был сильно индуцирован в этих клетках 2 нг / мл IFN-α2 (14.В 4 раза) и IFN-α21 (в 6,6 раза) (таблица I⇓). Потенциально подобные различия, специфичные для подтипа IFN-α, наблюдались для ряда других ISG (например, RING4, GBP-1, IFI16 и Caspase 1 ). Однако эти различия были менее значительными и менее последовательными среди трех проанализированных донорских образцов, и их еще предстоит установить. Следовательно, из проанализированных IP-10 оказался наиболее вероятным кандидатом на ген ответа, специфичный для подтипа IFN-α. Соответственно, индукцию мРНК и белка IP-10 анализировали дополнительно.

Индукция ISG подтипами IFN-α ^a

Индукция мРНК и белка IP-10 подтипами IFN-α

Кинетику индукции мРНК IP-10 сравнивали с помощью RPA с кинетикой для отбора IFN-α-индуцибельных мРНК как в DC, так и в T-клетках, обработанных IFN-α1 (2 и 20 нг / мл) или IFN-α2 ( 0,2 и 2 нг / мл) в течение 1, 4 и 8 ч (рис. 3⇓). Наблюдались различия 1) в кинетике индукции различных ISG, 2) между типами клеток и 3) между подтипами IFN-α.

Подтипы и типы клеток в профилях экспрессии мРНК, индуцированных IFN-α. A , Кинетика индукции мРНК ISG. Т-клетки и DC обрабатывали IFN-α1 (20 и 2 нг / мл) или IFN-α2 (2 и 0,2 нг / мл) в течение указанного времени. Аликвоты (5 мкг) цитоплазматической РНК анализировали на предмет индуцируемой экспрессии гена с помощью RPA с использованием зондов IP-10, iNOS, IL-12Rβ2, SOCS3 и SOCS1 с GAPDH в качестве контроля загрузки ( верхние панели ) и ISG-65K, 6-16 и 9-27 зонды и γ-актин в качестве контроля нагрузки ( нижние панели ).Данные представляют из трех независимых экспериментов. B , Количественный анализ данных постоянного тока. Гели ( A , левая панель ) подвергали количественному анализу PhosphorImager. Были рассчитаны данные для кратности индукции после поправки на контрольные нагрузки GAPDH и γ-актина. Данные для IP-10, ISG-56K, 6-16 и 9-27 представлены в качестве примеров.

Дифференциальная кинетика индукции.

Индукция мРНК SOCS3 была исключительно ранней и преходящей, индукция ISG-56K была ранней, но продолжительной, тогда как индукция даже первично индуцированных мРНК 6-16, 9-27 и STAT1 оказалась немного задержанной.Ясно, что точка обнаружения зависит от чувствительности анализа, но различия в формах (переходные и продолжительные) кривых остаются. Транскрипционный ответ для всех основных идентифицированных мРНК (Рис. 3⇑ и Таблица I well) хорошо установлен. Поскольку мы изучаем накопление мРНК, нельзя, конечно, исключить дополнительную модуляцию через различия в стабильности мРНК.

Дифференциалы типов клеток.

В ответ, например, на 2 нг / мл IFN-α2, IP-10 и iNOS сильно индуцировались в DC (IP-10, 242 раза через 4 часа; iNOS, 30 раз через 1 час; рис.3⇑ A , дорожки 8 и 4 ), но лишь незначительно в Т-клетках (IP-10, 4 раза через 4 часа; iNOS 2 раза через 1 час; A , полосы 21 и 17 ), таким образом подтверждая дифференциацию клеточного типа, наблюдаемую в макромассивах (Таблица I⇑). Дополнительным примером специфичности клеточного типа является ген IL-12Rβ2 , который активируется в Т-клетках (рис. 3 ( A , дорожки 19–22 ), но не в DC ( A , переулки 1–13 ).

дифференциала подтипа IFN-α.

В DC, все время анализируемого, мРНК IP-10 сильно индуцировалась IFN-α2 (0,2 и 2 нг / мл), но гораздо менее эффективно при 10-кратном повышении концентрации (2 и 20 нг / мл) IFN- α1 (рис. 3⇑). Это особенно очевидно в момент времени 8 часов на рис. 3 ⇑ A (сравните полосы 10, и 11 с 12 и 13 ) и соответствует фактическому отсутствию IFN-α1. -индуцированный ответ IP-10 через 8 ч в макромассиве (таблица I⇑).В соответствии с этим повышенные уровни мРНК IP-10 все еще определялись через 24 часа в ответ на IFN-α2 (2 нг / мл), но не на IFN-α1 (20 нг / мл) (данные не показаны). Более того, что важно, в ответ на IFN-α1 вырабатывалось значительно меньше белка IP-10, чем IFN-α2 (фиг. 4). Действительно, для индукции сравнимых количеств белка IP-10 требовались по крайней мере в 100 раз более высокие концентрации IFN-α1 (20 нг / мл), чем IFN-α2 (0,2 нг / мл) (рис. 4⇓), в результате согласуется с аналогичной разницей в эффективности индукции мРНК IP-10 (рис.3⇑, A , сравните полосы 2 и 5 , 6 и 9 , 10 и 13 и B ). Это контрастирует с данными для подавляющего большинства ISG, для которых индукция в ответ на IFN-α2 (0,2 и 2 нг) и в 10 раз более высокие концентрации IFN-α1 (2 и 20 нг / мл) были весьма сопоставимы ( Рис. 3⇑ и Таблица I⇑). Таким образом, хотя при абсолютных концентрациях, скорректированных в 10 раз, чтобы компенсировать 10-кратную разницу в специфической противовирусной активности и сродстве к рецепторам (см. Выше), IFN-α1 и -α2 могут проявлять аналогичную противовирусную активность и индуцировать большинство ISG в одинаковой степени, они гораздо больше различаются по своей способности индуцировать IP-10.Данные предполагают, что для оптимальной индукции IP-10, но не для большинства ISG, оцененных в таблице I⇑, может потребоваться, по крайней мере, в DC, дополнительный сигнал (ы), активируемый IFN-α2, но не IFN- α1.

Индукция белка IP-10 IFN-α1 и IFN-α2. DC стимулировали различными концентрациями IFN-α1 или -α2 в течение 18 часов. Среду из трех лунок собирали и объединяли, и уровни IP-10 определяли в двух экземплярах с помощью ELISA (материалы и методы , ).Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для двух независимых экспериментов.

Активация p38 необходима для оптимальной индукции IP-10

Промотор IP-10 содержит ISRE (54). Активированные STAT1 и -2 необходимы (вместе с уже существующим p48 / ISGF3γ / IRF9) для образования ISGF3, который опосредует ответы IFN-α через ISRE. Следовательно, можно разумно предположить, что активированные STAT1 и -2 необходимы (хотя и не обязательно достаточны) для индукции IP-10 с помощью IFN-α.Никакой разницы в активации STAT1 и -2 или в образовании ISGF3 в ответ на IFN-α1 и -α2 не наблюдалось (например, фиг. 1). Следовательно, различия в индукции IP-10 подтипами IFN-α1 и -α2 нельзя объяснить различиями в активации STAT. Помимо передачи сигналов Jak / STAT, пути киназ p38 и PI3 участвуют в ответах IFN-α (20, 21, 22, 23, 24). Поэтому была исследована роль этих путей в индукции IP-10 и других классических ISG в ответ на IFN-α1 и -α2.ДК обрабатывали IFN-α1 и -α2 (при 20 и 2 нг / мл соответственно) в отсутствие или в присутствии хорошо охарактеризованных ингибиторов киназы PI3 (LY294002) и p38 (SB203580) путей (рис. 5⇓). А ). Транскрипционные ответы оценивали через 8 ч, в этот момент разница между подтипами IFN-α при этих концентрациях была наиболее очевидной (рис. 3⇑ A ). Индукция IP-10 в ответ на оба подтипа IFN-α сильно ингибировалась SB203580, но не LY294002, что указывает на то, что путь киназы p38, но не PI3, участвует в регуляции этого гена.SB203580 ингибировал индукцию мРНК IP-10 дозозависимым образом, при этом ингибирование IP-10 наблюдалось с использованием всего лишь 1 мкМ этого соединения (данные не показаны). Напротив, этот ингибитор не влиял на индукцию мРНК ISG-56K, 2′-5′-олигоаденилатсинтетазы и 6-16 (фиг. 5⇓, A и B ) даже при значительно более высоких концентрациях. (20 мкМ; данные не показаны). Хотя LY294002 не влиял на индукцию мРНК IP-10, он был активен в этих клетках. Он сильно ингибировал накопление белка IP-10 в среде обработанных клеток (ELISA; три независимых эксперимента; данные не показаны).Скорее всего, это отражает потребность в киназе PI3 для секреции белка посредством экзоцитоза секреторных везикул (55).

Участие p38 в индукции IP-10. A , Влияние ингибиторов киназы PI3 и p38 на IFN-α-индуцированную экспрессию генов. DC обрабатывали IFN-α1 или IFN-α2 в концентрации 20 и 2 нг / мл соответственно в отсутствие или в присутствии LY294002 (LY) или SB203580 (SB) (оба по 10 мкМ) в течение 8 часов. Аликвоты (5 мкг) цитоплазматической РНК анализировали на предмет индуцируемой экспрессии гена с помощью RPA с использованием зондов IP-10, ISG-56K и 6-16 и GAPDH в качестве контроля загрузки. B , Количественное определение данных RPA с помощью анализа PhosphorImager двух независимых экспериментов (показано в A , а данные не показаны). Индукцию складок рассчитывали после поправки на контроль GAPDH. Данные представлены в виде процента ответа IFN-α2 в отсутствие ингибиторов (средние значения ± стандартная ошибка среднего). C , IFN-α индуцирует фосфорилирование p38. ДК обрабатывали IFN-α1 (20 нг / мл) или IFN-α2 (2 нг / мл) в течение 20 минут. Готовили лизаты цельных клеток и подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против фосфо-p38, отделяли и повторно зондировали антителами против p38.

В соответствии с требованием к p38 для оптимальной индукции IP-10, как IFN-α1 (при 20 нг / мл), так и IFN-α2 (при 2 нг / мл) индуцировали фосфорилирование p38 (рис. 5⇑ C ). Фосфорилирование протеинкиназы B, субстрата киназы PI3, не наблюдалось (данные не показаны). Очевидно, что путь p38 используется обоими подтипами IFN-α и необходим для оптимальной индукции IP-10, но не для других анализируемых ISG.

Обсуждение

В этом исследовании мы впервые представляем анализ передачи сигналов через Jak / STAT и дополнительные пути, а также экспрессии генов в человеческих Т-клетках и DC в ответ на различные подтипы IFN-α.Наблюдались существенные вариации, включая различия в ответах IFN-α-подтипа и клеточного типа и экспрессии ISG. Важно отметить, что хемокин IP-10 дифференциально индуцировался в DC под действием IFN-α1 по сравнению с IFN-α2 и IFN-α21. При физиологических концентрациях (2 нг / мл) мРНК и белок IP-10 сильно индуцировались IFN-α2 и -α21, но слабо — IFN-α1 (таблица I и фиг. 3 и 4). В отличие от других проанализированных ISG, увеличение концентрации IFN-α1 до 20 нг / мл не приводило к индукции уровней IP-10, сравнимых с уровнями, индуцированными 2 нг / мл IFN-α2.

IP-10 был первоначально идентифицирован как IFN-γ-индуцированный белок (56). Исследования in vivo с использованием либо нейтрализующих IP-10 Abs, либо мышей с дефицитом IP-10 показывают, что этот хемокин играет важную неизбыточную роль в привлечении / перемещении эффекторных клеток Th2 в участки воспаления ткани (57, 58). Было высказано предположение, что ранняя экспрессия, в частности IP-10 in vivo, имеет решающее значение для установления защитных клеточных иммунных ответов против определенных патогенов, и что ответственны за это компоненты врожденной иммунной системы, а не IFN-γ (57).IFN-αβ являются вероятными кандидатами на роль таких компонентов. Действительно, недавно было показано, что индуцированная IFN-αβ продукция IP-10 DC в ответ на Mycobacterium tuberculosis имеет решающее значение для избирательного рекрутирования активированных Т-клеток (59). Следовательно, есть основания полагать, что нарушение индукции IP-10 под действием IFN-α1 в физиологических концентрациях может иметь важные последствия для иммунной регуляции. Следует отметить, что IFN-α1 играет важную роль в ответе на IFN-α, потому что он обычно является одним из основных продуцируемых подтипов (49, 50, 51).

Помимо защитной роли IP-10 при инфекциях, требующих сильных клеточно-опосредованных иммунных ответов, IP-10 также может способствовать прогрессированию определенных заболеваний. Экспрессия IP-10 наблюдалась при многих воспалительных / аутоиммунных заболеваниях Th2-типа, включая псориаз (60), рассеянный склероз (61, 62), ревматоидный артрит (63) и диабет 1 типа (64). Более того, мышиные модели аутоиммунитета Th2-типа in vivo установили критическую роль IP-10 в возникновении и прогрессировании заболевания (58, 65, 66).Очевидно, что индукция IP-10 и последующее привлечение клеток Th2 к участкам воспаления нежелательны при этих заболеваниях. В этом отношении интересно отметить, что терапевтическое применение IFN-α противопоказано пациентам с Th2-связанными расстройствами в анамнезе. Более того, были клинические примеры, когда введение IFN-α вызывало индукцию аутоиммунных заболеваний (67, 68) и приводило к обострению псориатических поражений (69). Принимая во внимание важную роль IP-10 в воспалительных заболеваниях Th2-типа, наблюдение, что индукция этого хемокина нарушается в ответ на IFN-α1, может иметь клиническое значение, поскольку этот подтип может быть более подходящим кандидатом для терапевтического применения в случаях, когда Воспалительные реакции Th2 нежелательны.Хотя эту возможность еще предстоит установить, удивительно, что IFN-α1 вызывал меньше побочных эффектов, чем IFN-α2, у пациентов со злокачественными заболеваниями (70).

В двух предыдущих исследованиях использовались инструменты глобального профилирования экспрессии генов для решения связанного с этим вопроса о том, существуют ли функциональные различия между IFN-α2 и IFN-β (37, 71). Эти исследования продемонстрировали, что при данной концентрации IFN-β индуцировало больше генов, чем -α2 (37, 71), но модели индукции ISG становились идентичными при увеличении концентрации IFN-α2 (37) — результат схожий. к этому для большинства ISG в ответ на IFN-α2 по сравнению с IFN-α1 в этом исследовании (Таблица I⇑).Принимая во внимание тот факт, что IFN-αβ действует через общий рецептор, это перекрытие в ответах, возможно, неудивительно. Тем не менее, текущие данные показывают, что даже при относительно высокой физиологической концентрации 2 нг / мл индукция IP-10 IFN-α1 серьезно нарушалась. Хотя индукция IFN-αβ может быть высокой в ​​ответ, по крайней мере, на некоторые вирусные инфекции (72), она может быть относительно низкой в ​​ответ на другие патогены (6), и есть также хорошие доказательства низкой конститутивной экспрессии (73). Таким образом, различия в действиях IFN-αβ при более низких концентрациях также могут быть биологически значимыми.

Были обнаружены существенные количественные различия между IFN-α1, -α2 и -α21 в способности активировать STAT1 до -5 и спектре ISG. При высоких концентрациях IFN-α все подтипы индуцировали фосфорилирование STAT1 до -5 в Т-клетках и STAT1 до -3 в DC (STAT4 и -5 не анализировались) и аналогичные паттерны экспрессии ISG (рис. 1 и таблица I). ). Различия между подтипами в этом отношении количественные, а не качественные и аналогичны тем, которые описаны для IFN-α2 и IFN-β (37).Важно отметить, что никаких существенных различий в кинетике активации STAT разными подтипами в диапазоне концентраций не наблюдалось (рис. 2, данные не представлены). Следовательно, нет очевидной специфичности активации STAT для этих конкретных подтипов в этих конкретных клетках. Недавно Cull et al. (38) сообщили о селективной активации STAT5 в ответ на различные подтипы IFN-α в иммортализованной линии клеток эритробластов мыши. Тем не менее, остается возможным, что это снова отражает количественную разницу в зависимости от концентрации, особенно потому, что активация STAT1 и -3 различными подтипами, как было показано, сильно зависит от используемой дозы.

Менее эффективное фосфорилирование / активация STAT под действием IFN-α1, чем -α2 (рис. 1⇑), коррелирует с известным более низким сродством связывания с рецептором IFN-αβ (в 20 раз ниже K _d ) (39) и более низкая (в 5-20 раз) специфическая противовирусная активность в зависимости от типа клеток (52). Однако индукция большинства ISG была только в 2–4 раза ниже в ответ на IFN-α1, чем на IFN-α2 и -α21 (все при 2 нг / мл). Увеличение концентрации IFN-α1 до 20 нг / мл приводило к индукции ISG, сравнимой с IFN-α2 и -α21 (за исключением IP-10), несмотря на более низкую активацию STAT даже при этой более высокой концентрации IFN-α1 (Таблица I⇑ и Рис. .1⇑). Таким образом, количественная разница между IFN-α1 и IFN-α2 или -α21 оказывается меньше для индукции ISG, чем для активации STAT. Это произошло не просто из-за различий в чувствительности используемых анализов, потому что относительно небольшие различия в индукции ISG наблюдались в широком диапазоне концентраций (для IFN-α1, от 20 до 0,2 нг / мл; IFN-α2, от 2 до 0,02 нг / мл), и формы кривых доза-ответ для IFN-α1 и IFN-α2 были аналогичными (данные не показаны). Ранее сообщалось о различиях между активацией STAT и функциональными ответами; например, различия в противовирусной и антипролиферативной активности ряда гибридов IFN-α2 / 21 не коррелировали с их способностью активировать STAT1 / 2 (45) и противовирусной активностью IFN-β в клеточной линии, экспрессирующей усеченный IFN. Рецептор -αβ был сильно нарушен, в отличие от активации передачи сигналов Jak / STAT (43).Соответственно, вероятно, будут задействованы дополнительные факторы, ограничивающие скорость.

Оба пути киназы p38 и PI3 участвуют в передаче сигналов IFN-α (20, 21, 22, 23, 24). В DC ​​активация p38, но не киназы PI3, по-разному требовалась для оптимальной индукции IP-10 по сравнению с другими мРНК ISG (фиг. 5⇑). И IFN-α1, и IFN-α2 активируют киназу (ы) p38 (рис. 5⇑ C ). Соответственно, дифференциальная индукция p38 кажется маловероятной, чтобы быть основой наблюдаемой разницы в индукции IP-10 в ответ на два подтипа IFN-α.Сообщалось о потребности в p38 как для ISRE-, так и для GAS-управляемой экспрессии репортерных конструкций (22, 23, 24). Требование активации p38 для IFN-α для оптимальной индукции IP-10, насколько нам известно, является первой демонстрацией участия этого пути в регуляции эндогенного ISG с помощью IFN-α. Таким образом, среди ISG, проанализированных в этом исследовании, IP-10 был уникальным в том смысле, что он 1) дифференциально регулируется подтипами IFN-α, 2) зависит от активации p38 и 3) индуцируется в DC, но не в Т-клетках.

Хотя это исследование не является конкретным направлением, оно также предоставило дополнительные доказательства специфичности клеточного типа для ответа на IFN-α (см. Ссылку 47) и основных различий в кинетике экспрессии подмножеств ISG. Помимо IP-10, примеры специфичности клеточного типа включают индукцию iNOS в DC, но не в T-клетках, и IL-12Rβ2 в T-клетках, но не в DC (таблица I и фиг. 3). В соответствии с последним, IL-12Rβ2 является геном, чувствительным к STAT4, а незрелые DC не экспрессируют STAT4 (74, 75, 76).Среди исследованных мРНК ISG наблюдалась очень разная кинетика накопления (рис. 3⇑ B и данные не представлены). Например, SOCS1 показал очень раннюю переходную кинетику, IP-10 и ISG-56K были аналогичными временными, но с небольшой задержкой, тогда как 6-16, 9-27 и STAT1 показали более устойчивую индукцию (рис. 3⇑). Очевидно, что точка обнаружения зависит от чувствительности анализа и выбранных временных точек, но различия в форме кривых, которые могут отражать или не отражать основные различия в стабильности мРНК, остаются.Интересно, что такие различия не наблюдались в аналогичном анализе для IFN-α2 в клетках фибросаркомы человека HT1080. В них накопление мРНК для всех 150 проанализированных ISG было продолжительным и оптимальным через 6-8 часов (ссылка 47; J. F. Schlaak и I. M. Kerr, неопубликованные данные). Эти противоположные результаты подчеркивают как сложность ответов, так и их зависимость от типа клеток. Очевидно, что в этой области данные, полученные в одной системе ячеек, не обязательно экстраполировать на другие.

В заключение, настоящее исследование предоставляет новую информацию об ответах подтипа IFN-α в человеческих Т-клетках и DC.Наблюдались существенные различия в активности подтипа IFN-α, в специфичности типа клеток и в требованиях к пути p38 MAPK. Индукция IP-10 была наиболее ярким примером в этом отношении. Дальнейшие примеры вариаций активности IFN-α-подтипа, вероятно, по-прежнему будут иметь важное значение для развития понимания роли (-ей) различных подтипов в иммунном ответе.

Благодарности

Мы благодарим докторов наук. Дорин Кантрелл, Патрик Костелло, Сандра Диболд и Факундо Батиста за критическое чтение рукописи.

Сноски

• №1 Работа поддержана грантом Федора-Линена от Общества Александра фон Гумбольдта компании J.F.S.

• №2 Cancer Research UK Лондонский научно-исследовательский институт состоит из лабораторий Lincoln’s Inn Fields и Clare Hall, входивших в состав бывшего Императорского фонда исследований рака после слияния Императорского фонда исследований рака с Кампанией по исследованию рака в феврале 2002 года.

• №3 Фактический адрес: Эссенский университет, отделение гастроэнтерологии и гепатологии, Hufelandstrasse 55, 45122 Essen, Germany.

• ↵4 Адрес для корреспонденции и перепечатки запросов на перепечатку д-ру Яну М. Керру, Лондонский исследовательский институт рака, Великобритания, Lincoln’s Inn Fields Laboratories, 44 Lincoln’s Inn Fields, London WC2A 3PX, UK Адрес электронной почты: ian.kerr {at} рак .org.uk

• ↵5 В статье использованы сокращения: DC — дендритная клетка; Jak, Janus kinase; ISG, IFN-стимулированный ген; ISGF3, фактор ISG 3; IRF, регуляторный фактор IFN; ISRE, IFN-стимулированный ответный элемент; ГАЗ, γ-активированная последовательность; PI3, фосфатидилинозитол 3; MAP, митоген-активированный белок; IP-10, IFN-γ-индуцибельный белок-10; iNOS, индуцибельная NO-синтаза; SOCS, супрессор передачи сигналов цитокинов; RPA, анализ защиты от РНКазы.

• Получено 15 апреля 2003 г.
• Принято 2 сентября 2003 г.

• Авторское право © 2003 Американская ассоциация иммунологов

Ссылки

1. ↵

   Герберман Р. Б. 1997. Влияние α-интерферонов на иммунную функцию. Семин. Онкол. 24: (Прил. 9) : S9.78.

2. ↵

   De Maeyer, E., J. De Maeyer-Guignard.1998. Интерфероны типа I. Int. Rev. Immunol. 17:53.

3. ↵

   Беларделли, Ф., И. Грессер. 1996. Игнорированная роль интерферона типа I в ответе Т-клеток: значение для его клинического использования. Иммунол. Сегодня 17:369.

4. ↵

   Gutterman, J. U .. 1994. Цитокиновая терапия: уроки интерферона-α. Proc. Natl. Акад. Sci. США 91: 1198.

5. ↵

   Дифенбах, А., Х. Шиндлер, Н. Донхаузер, Э. Лоренц, Т. Ласкей, Дж. МакМикинг, М. Роллингхофф, И. Грессер, К. Богдан. 1998. Интерферон 1-го типа (IFNα / β) и синтаза оксида азота 2-го типа регулируют врожденный иммунный ответ на простейших паразитов. Иммунитет 8:77.

6. ↵

   Синг, А., Т. Мерлин, Х. П. Кнопф, П. Дж. Нильсен, Х. Лоппнов, К. Галанос, М. А. Фройденберг. 2000. Бактериальная индукция β-интерферона у мышей является функцией липополисахаридного компонента.Заразить. Иммун. 68: 1600.

7. ↵

   Фаррар, Дж. Д., К. М. Мерфи. 2000. Развитие интерферонов I типа и Т-хелперов. Иммунол. Сегодня 21: 484.

8. ↵

   Бирон, К. А. 2001. Интерфероны α и β как иммунные регуляторы: новый взгляд. Иммунитет 14: 661.

9. ↵

   Ле Бон, А., Дж. Скьявони, Дж. Д’Агостино, И. Грессер, Ф. Беларделли, Д.F. Жесткий. 2001. Интерфероны типа I сильно усиливают гуморальный иммунитет и могут способствовать переключению изотипа, стимулируя дендритные клетки in vivo. Иммунитет 14: 461.

10. ↵

    Weissmann, C., H. Weber. 1986. Гены интерферона. Прог. Nucleic Acid Res. Мол. Биол. 33: 251.

11. ↵

    Пестка, С. 1997. Виды интерферона-α человека и гибридные белки. Семин. Онкол. 24: (Прил. 9) : S9.4.

12. ↵

    Узе Г., Лутфалла Г., Грессер И. 1990. Генетический перенос функционального рецептора интерферона-α человека в клетки мыши: клонирование и экспрессия его кДНК. Ячейка 60: 225.

13. ↵

    Новик, Д., Б. Коэн, М. Рубинштейн. 1994. Рецептор интерферона α / β человека: характеристика и молекулярное клонирование. Ячейка 77: 391.

14. ↵

    Лутфалла, Г., SJ Holland, E. Cinato, D. Monneron, J. Reboul, NC Rogers, JM Smith, GR Stark, K. Gardiner, KE Mogensen, et al 1995. Мутантные клетки U5A дополняются субъединицей рецептора интерферона-αβ, генерируемой путем альтернативного процессинга нового члена кластера генов рецепторов цитокинов. EMBO J. 14: 5100.

15. ↵

    Старк, Г. Р., И. М. Керр, Б. Р. Уильямс, Р. Х. Сильверман, Р. Д. Шрайбер. 1998. Как клетки реагируют на интерфероны.Анну. Rev. Biochem. 67: 227.

16. ↵

    Чо, С. С., К. М. Бэкон, К. Сударшан, Р. К. Рис, Д. Финблум, Р. Пайн, Дж. Дж. О’Ши. 1996. Активация STAT4 IL-12 и IFN-α: доказательства участия лиганд-индуцированного фосфорилирования тирозина и серина. J. Immunol. 157: 4781.

17. ↵

    Yu, C. R., J. X. Lin, D. W. Fink, S. Akira, E. T. Bloom, A. Yamauchi. 1996. Дифференциальное использование активатора сигнального преобразователя киназы Janus сигнальных путей транскрипции при стимуляции естественных киллеров человека IL-2, IL-12 и IFN-α.J. Immunol. 157: 126.

18. ↵

    Матикайнен, С., Т. Саренева, Т. Ронни, А. Лехтонен, П. Дж. Коскинен, И. Юлкунен. 1999. Интерферон-α активирует множество белков STAT и активирует связанные с пролиферацией гены IL-2Rα , c- myc и pim-1 в Т-клетках человека. Кровь 93: 1980.

19. ↵

    Гупта, С., М. Цзян, А. Б. Пернис. 1999. IFN-α активирует Stat6 и приводит к образованию комплексов Stat2: Stat6 в B-клетках.J. Immunol. 163: 3834.

20. ↵

    Янг, К. Х., А. Мурти, С. Р. Пфеффер, Дж. Г. Ким, Д. Б. Доннер, Л. М. Пфеффер. 2001. Интерферон α / β способствует выживанию клеток, активируя ядерный фактор κB через фосфатидилинозитол-3-киназу и Akt. J. Biol. Chem. 276: 13756.30.

21. ↵

    Рани М. Р., Л. Хибберт, Н. Сиземор, Г. Р. Старк, Р. М. Рансохофф. 2002. Потребность в фосфоинозитид-3-киназе и Akt для опосредованной интерфероном-β индукции гена β- R1 ( SCYB11 ).J. Biol. Chem. 277: 38456.

22. ↵

    Го, К. К., С. Дж. Хак, Б. Р. Уильямс. 1999. Киназа p38 MAP необходима для фосфорилирования серина STAT1 и активации транскрипции, индуцированной интерферонами. EMBO J. 18: 5601.

23. ↵

    Уддин, С., Б. Майчжак, Дж. Вудсон, П. Арункумар, Ю. Алсайед, Р. Пайн, П. Р. Янг, Э. Н. Фиш, Л. К. Платаниас. 1999. Активация митоген-активируемой протеинкиназы p38 интерферонами I типа.J. Biol. Chem. 274: 30127.

24. ↵

    Уддин, С., Ф. Лекмине, Н. Шарма, Б. Майчжак, И. Майер, П. Р. Янг, Г. М. Бокоч, Э. Н. Фиш, Л. К. Платаниас. 2000. Путь митоген-активируемой протеинкиназы Rac1 / p38 необходим для интерферон-зависимой транскрипционной активации, но не фосфорилирования серина белков Stat. J. Biol. Chem. 275: 27634.

25. ↵

    Дэвид М., Э.Петрикоин, III, К. Бенджамин, Р. Пайн, М. Дж. Вебер, А. К. Ларнер. 1995. Потребность в активности киназы MAP (ERK2) в экспрессии генов, стимулированной интерфероном α и β интерфероном, через белки STAT. Наука 269: 1721.

26. ↵

    Hiscott, J., K. Cantell, C. Weissmann. 1984. Дифференциальная экспрессия генов интерферона человека. Nucleic Acids Res. 12: 3727.

27. ↵

    Макдональд, Н. Дж., D. Kuhl, D. Maguire, D. Naf, P. Gallant, A. Goswamy, H. Hug, H. Bueler, M. Chaturvedi, J. de la Fuente, et al 1990. Различные пути опосредуют индуцируемость вирусом гены IFN-α1 и IFN -β человека. Ячейка 60: 767.

28. ↵

    Мари, И., Дж. Э. Дурбин, Д. Э. Леви. 1998. Дифференциальная вирусная индукция отдельных генов интерферона-α посредством положительной обратной связи через фактор регуляции интерферона-7. EMBO J. 17: 6660.

29. ↵

    Лин, Р., П. Генин, Ю. Мамане, Дж. Хискотт. 2000. Селективное связывание ДНК и ассоциация с коактиватором связывающего белка CREB способствуют дифференциальной активации генов интерферона α / β факторами регуляции интерферона 3 и 7. Mol. Клетка. Биол. 20: 6342.

30. ↵

    Барнс, Б. Дж., П. А. Мур, П. М. Пита. 2001. Вирус-специфическая активация нового фактора регуляции интерферона, IRF-5, приводит к индукции различных генов интерферона α.J. Biol. Chem. 276: 23382.

31. ↵

    Реберг, Э., Б. Келдер, Э. Г. Хоул, С. Пестка. 1982. Удельная молекулярная активность рекомбинантных и гибридных лейкоцитарных интерферонов. J. Biol. Chem. 257: 11497.

32. ↵

    Белл, Д. М., Н. Дж. Робертс, младший, К. Б. Холл. 1983. Различные противовирусные спектры активности интерферона макрофагов человека. Природа 305: 319.

33. ↵

    Рыба, Е.Н., К. Банерджи, Н. Стеббинг. 1983. Подтипы лейкоцитарного интерферона человека обладают различной антипролиферативной и противовирусной активностью в отношении клеток человека. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 112: 537.

34. ↵

    Фостер, Г. Р., О. Родригес, Ф. Гуз, Э. Шульте-Фролинде, Д. Теста, М. Дж. Ляо, Г. Р. Старк, Л. Ледбитер, Х. К. Томас. 1996. Различная относительная активность подтипов интерферона-α человеческого клеточного происхождения: IFN-α8 обладает очень высокой противовирусной активностью.J. Interferon Cytokine Res. 16: 1027.

35. ↵

    Йео, В. С., К. М. Лоусон, М. В. Бейльгарц. 1998. Противовирусная активность отдельных подтипов мышиного IFN-α in vivo: внутримышечная инъекция конструкций экспрессии IFN снижает репликацию цитомегаловируса. J. Immunol. 160: 2932.

36. ↵

    Hibbert, L., G.R. Foster. 1999. Интерфероны человека типа I сильно различаются по своему влиянию на пролиферацию первичных В-клеток.J. Interferon Cytokine Res. 19: 309.

37. ↵

    да Силва, А. Дж., М. Брикельмайер, Г. Р. Мажо, А. В. Лукашин, Дж. Пейман, А. Уитти, П. С. Хохман. 2002. Сравнение паттернов экспрессии генов, индуцированных обработкой эндотелиальных клеток пупочной вены человека IFN-α2b и IFN-β1a: понимание функциональной взаимосвязи между отдельными интерферонами типа I, которые действуют через общий рецептор. J. Interferon Cytokine Res. 22: 173.

38. ↵

    Калл, В.С., П. А. Тилбрук, Э. Дж. Бартлетт, Н. Л. Брекало, К. М. Джеймс. 2003. Дифференциальная терапия интерфероном I типа при эритролейкозе: специфичность активации STAT. Кровь 101: 2727.

39. ↵

    Йонехара, С., М. Йонехара-Такахаши, А. Исии, С. Нагата. 1983. Различное связывание человеческого интерферона α1 и α2 с общими рецепторами на человеческих и бычьих клетках: исследования с рекомбинационными интерферонами, продуцируемыми в Escherichia coli . J. Biol.Chem. 258: 9046.

40. ↵

    Ху, Р., Ю. Ган, Дж. Лю, Д. Миллер, К. К. Зун. 1993. Доказательства множественных сайтов связывания для нескольких компонентов человеческого лимфобластоидного интерферона-α. J. Biol. Chem. 268: 12591.

41. ↵

    Абрамович К., Л. М. Шульман, Э. Ратовицкий, С. Харроч, М. Тови, П. Эйд, М. Ревель. 1994. Дифференциальное фосфорилирование тирозина цепи IFNAR рецептора интерферона типа I и связанного поверхностного белка в ответ на IFN-α и IFN-β.EMBO J. 13: 5871.

42. ↵

    Платаниас, Л. К., С. Уддин, П. Домански, О. Р. Коламоничи. 1996. Различия в передаче сигналов интерферона α и β: интерферон β избирательно индуцирует взаимодействие субъединиц α и βL рецептора интерферона I типа. J. Biol. Chem. 271: 23630.

43. ↵

    Domanski, P., O. W. Nadeau, L.C. Platanias, E. Fish, M. Kellum, P. Pitha, O.R. Colamonici.1998. Дифференциальное использование субъединицы βL рецептора интерферона I типа (IFN) определяет специфичность передачи сигналов для IFNα2 и IFNβ. J. Biol. Chem. 273: 3144.

44. ↵

    Леверенц, М., К. Э. Могенсен, Г. Узе. 1998. Общие рецепторные компоненты, но отдельные комплексы для α и β интерферонов. J. Mol. Биол. 282: 585.

45. ↵

    Ху, Р., Дж. Бекиш, М. Хейс, С. Одет, Дж. Билер, Э. Петрикоин, К.Зун. 1999. Дивергенция связывания, передачи сигналов и биологических ответов на рекомбинантный гибридный IFN человека. J. Immunol. 163: 854.

46. ↵

    Athie-Morales, V., H. Flotow, K. L. Hilyard, D. A. Cantrell. 2000. IL-12 селективно регулирует STAT4 через фосфатидилинозитол-3-киназу и Ras-независимые пути передачи сигнала. Евро. J. Immunol. 30: 1425.

47. ↵

    Шлаак, Дж. Ф., К. М. Хилкенс, А.П. Коста-Перейра, Б. Штробл, Ф. Абергер, А. М. Фришауф, И. М. Керр. 2002. Типы клеток и специфичные для доноров транскрипционные ответы на интерферон-α: использование индивидуальных массивов генов. J. Biol. Chem. 277: 49428.27.

48. ↵

    Мюллер М., К. Лакстон, Дж. Бриско, К. Шиндлер, Т. Импрота, Дж. Э. Дарнелл-младший, Г. Р. Старк, И. М. Керр. 1993. Комплементация мутантной клеточной линии: центральная роль полипептида 91 кДа ISGF3 в путях передачи сигналов интерферона-α и -γ.EMBO J. 12: 4221.

49. ↵

    Лаллеманд, К., П. Лебон, П. Рицца, Б. Бланшар, М. Г. Тови. 1996. Конститутивная экспрессия определенных изотипов интерферона в лейкоцитах периферической крови здоровых людей и в промоноцитарных клетках U937. J. Leukocyte Biol. 60: 137.

50. ↵

    Поль Г., У. Хеллман, Э. Лундгрен, С. Лундберг. 1994. Пять доминирующих подтипов α-интерферона вируса Сендай стимулировали лейкоциты человека.J. Interferon Res. 14: S63.

51. ↵

    Фостер, Г. Р., Н. Б. Финтер. 1998. Все ли интерфероны человека I типа эквивалентны ?. J. Viral Hepat. 5: 143.

52. ↵

    Streuli, M., A. Hall, W. Boll, W. E. Stewart, II, S. Nagata, C. Weissmann. 1981. Специфичность клеток-мишеней двух видов человеческого интерферона-α, продуцируемого в Escherichia coli , и гибридных молекул, производных от них.Proc. Natl. Акад. Sci. США 78: 2848.

53. ↵

    Zoon, K. C., D. Miller, J. Bekisz, D. zur Nedden, J. C. Enterline, N. Y. Nguyen, R.Q. Hu. 1992. Очистка и характеристика множества компонентов человеческого лимфобластоидного интерферона-α. J. Biol. Chem. 267: 15210.

54. ↵

    Омори Ю., Т. А. Гамильтон. 1995. Стимулируемый интерфероном элемент ответа и сайт κB опосредуют синергическую индукцию транскрипции мышиного гена IP-10 IFN-γ и TNF-α.J. Immunol. 154: 5235.

55. ↵

    Одзава, К., Т. Масудзима, К. Икеда, Ю. Кодама, Ю. Нономура. 1996. С помощью светового микроскопа с видеоусилением выявлены различные пути ингибирующего действия вортманнина на экзоцитоз. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 222: 243.

56. ↵

    Lustre, A. D., J. C. Unkeless, J. V. Ravetch. 1985. γ-Интерферон транскрипционно регулирует ген раннего ответа, содержащий гомологию с белками тромбоцитов.Природа 315: 672.

57. ↵

    Хан, И. А., Дж. А. Маклин, Ф. С. Ли, Л. Кашотти, Э. ДеХаан, Дж. Д. Шварцман, А. Д. Ластер. 2000. IP-10 имеет решающее значение для транспортировки эффекторных Т-клеток и выживания хозяина при инфекции Toxoplasma gondii . Иммунитет 12: 483.

58. ↵

    Dufour, J. H., M. Dziejman, M. T. Liu, J. H. Leung, T. E. Lane, A. D. Luster. 2002. Мыши с дефицитом IFN-γ-индуцируемого белка 10 (IP-10; CXCL10) обнаруживают роль IP-10 в генерации и перемещении эффекторных Т-клеток.J. Immunol. 168: 3195.

59. ↵

    Р. Ланде, Э. Джакомини, Т. Грасси, М. Э. Ремоли, Э. Иона, М. Миеттинен, И. Юлкунен, Э. М. Кочча. 2003. IFN-αβ, высвобождаемый дендритными клетками человека, инфицированными Mycobacterium tuberculosis , индуцирует экспрессию CXCL10: избирательное привлечение NK и активированных Т-клеток. J. Immunol. 170: 1174.

60. ↵

    Готтлиб А.Б., Ластер А.Д., Д.Н. Познетт, Д. М. Картер. 1988. Обнаружение индуцированного γ-интерфероном белка IP-10 в псориатических бляшках. J. Exp. Med. 168: 941.

61. ↵

    Балашов, К. Э., Дж. Б. Роттман, Х. Л. Вайнер, В. В. Хэнкок. 1999. CCR5 ⁺ и CXCR3 ⁺ Т-клетки увеличиваются при рассеянном склерозе, и их лиганды MIP-1α и IP-10 экспрессируются в демиелинизирующих поражениях головного мозга. Proc. Natl. Акад. Sci. США 96: 6873.

62. ↵

    Соренсен, Т.L., M. Tani, J. Jensen, V. Pierce, C. Lucchinetti, VA Folcik, S. Qin, J. Rottman, F. Sellebjerg, RM Strieter, et al. 1999. Экспрессия специфических хемокинов и хемокиновых рецепторов в центральная нервная система больных рассеянным склерозом. J. Clin. Вкладывать деньги. 103: 807.

63. ↵

    Патель, Д. Д., Дж. П. Захария, Л. П. Уичард. 2001. Лиганды CXCR3 и CCR5 в синовиальной оболочке ревматоидного артрита. Clin. Иммунол. 98:39.

64. ↵

    Шимада, А., Дж. Моримото, К. Кодама, Р. Судзуки, Ю. Оикава, О. Фунае, А. Касуга, Т. Сарута, С. Наруми. 2001. Повышенный уровень сывороточного IP-10 наблюдается при диабете 1 типа. Уход за диабетом 24: 510.

65. ↵

    Лю М. Т., Х. С. Кейрстед, Т. Э. Лейн. 2001. Нейтрализация хемокина CXCL10 снижает инвазию воспалительных клеток и демиелинизацию и улучшает неврологическую функцию в вирусной модели рассеянного склероза. J. Immunol. 167: 4091.

66. ↵

    Саломон, И., Н. Нецер, Г. Вильдбаум, С. Шиф-Цук, Г. Маор, Н. Карин. 2002. Нацеливание на функцию IFN-γ-индуцируемого белка 10 подавляет продолжающийся адъювантный артрит. J. Immunol. 169: 2685.

67. ↵

    Роннблом, Л. Э., Г. В. Альм, К. Оберг. 1991. Аутоиммунные явления у больных злокачественными карциноидными опухолями при лечении интерфероном-α. Acta Oncol. 30: 537.

68. ↵

    Бози, Э., Минелли Р., Э.Баззигалуппи, М. Салви. 2001. Фульминантный аутоиммунный диабет 1 типа во время терапии интерфероном-α: случай Th2-опосредованного заболевания ?. Диабет. Med. 18: 329.

69. ↵

    Quesada, J. R., J. U. Gutterman. 1986. Псориаз и α-интерферон. Ланцет 1: 1466.

70. ↵

    Хокинс, М. Дж., Э. К. Борден, Дж. А. Мерритт, Б. С. Эдвардс, Л. А. Болл, Э. Гроссбард, К. Дж. Саймон. 1984. Сравнение биологических эффектов двух рекомбинантных человеческих интерферонов α (rA и rD) на человека.J. Clin. Онкол. 2: 221.

71. ↵

    Дер, С. Д., А. Чжоу, Б. Р. Уильямс, Р. Х. Сильверман. 1998. Идентификация генов, дифференциально регулируемых интерфероном α, β или γ с использованием массивов олигонуклеотидов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 95: 15623.

72. ↵

    Маркус, П. И., М. Дж. Секеллик. 1994. Индукция интерферона: регуляция как вирусом, так и клеткой. Хоккайдо Игаку Засси 69: 1320.

73. ↵

    Танигучи, Т., А. Такаока. 2001. Слабый сигнал для сильных ответов: пересмотр интерферона-α / β. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 378.

74. ↵

    Sinigaglia, F., D. D’Ambrosio, P. Panina-Bordignon, L. Rogge. 1999. Регулирование оси IL-12 / IL-12R: критический шаг в дифференцировке Т-хелперных клеток и эффекторной функции. Иммунол. Откр.170: 65.

75. ↵

    Фрухт, Д. М., М. Аринджер, Дж. Галон, К. Даннинг, М.Браун, С. Фан, М. Чентола, К. Ю. Ву, Н. Ямада, Х. Эль-Габалави, Дж. Дж. О’Ши. 2000. Stat4 экспрессируется в активированных моноцитах периферической крови, дендритных клетках и макрофагах в местах Th2-опосредованного воспаления. J. Immunol. 164: 4659.

76. ↵

    Fukao, T., D. M. Frucht, G. Yap, M. Gadina, J. J. O’Shea, S. Koyasu. 2001. Индуцируемая экспрессия Stat4 в дендритных клетках и макрофагах и его критическая роль в врожденных и адаптивных иммунных ответах.J. Immunol. 166: 4446.

Вирус Эпштейна-Барра LF2: антагонист интерферона I типа

РЕФЕРАТ

При вирусной инфекции основной защитой, обеспечиваемой иммунной системой хозяина, является активация опосредованного интерфероном (IFN) противовирусного пути, который опосредуется Факторы регуляции IFN (IRF). Для завершения своего жизненного цикла вирусы должны модулировать иммунные ответы хозяина, опосредованные IFN. Несмотря на связь со значительными проблемами со здоровьем человека, активность вируса Эпштейна-Барра (EBV), вызывающего опухоль человека герпесвируса, по ускользанию от IFN-опосредованного врожденного иммунитета хозяина не была хорошо охарактеризована.Для поиска генов EBV, которые блокируют передачу сигнала IFN, мы провели скрининг открытых рамок считывания EBV на их способность блокировать IFN-α / β-опосредованную экспрессию люциферазы при заражении вирусом Сендай. Этот скрининг демонстрирует, что белок-тегумент LF2 EBV специфически взаимодействует с центральным ингибирующим ассоциативным доменом IRF7, и это взаимодействие приводит к ингибированию димеризации IRF7, которая подавляет продукцию IFN-α и IFN-опосредованный иммунитет. Это демонстрирует новый механизм иммунного уклонения EBV LF2 при блокировании клеточного IRF7-опосредованного врожденного иммунитета.

Врожденный иммунный ответ — это передовая линия защиты хозяина от микробной инфекции (15). Центральное место в противовирусном ответе хозяина занимает продукция интерферона I типа (IFN), которая тонко регулируется членами семейства регуляторных факторов IFN (IRF) (5, 15, 21-23). Это семейство участвует в противовирусной защите, иммунной регуляции, регуляции роста клеток и апоптозе (3, 18, 33). Отличительной особенностью этого семейства является высококонсервативный аминоконцевой ДНК-связывающий домен (DBD).Два близкородственных члена этого семейства, IRF3 и IRF7, по-видимому, являются основными преобразователями вирусной передачи сигналов при индукции IFN типа I (19, 22, 23, 27, 35). Транскрипционная активность IRF3 и IRF7 зависит от C-концевого фосфорилирования, опосредованного IKK-родственными киназами TBK1 и IKKε (12, 16, 36). Фосфорилирование запускает серию изменений в IRF3 и IRF7, включая изменение конформации, димеризацию через уникальный C-концевой домен, известный как ингибирующий связанный домен (IAD), и ядерную транслокацию.Эти изменения приводят к связыванию ДНК с IRF3 и IRF7 через их экспонированные DBD, что в конечном итоге активирует транскрипцию IFN типа I (28, 30, 39).

В то время как IRF3 является повсеместным белком, IRF7 является IFN-индуцибельным и преимущественно существует в клетках лимфоидного происхождения (1, 2, 4). Считается, что при вирусной инфекции IFN-β, экспрессия которого в основном регулируется IRF3, продуцируется первым из-за его повсеместной экспрессии. IFN-β после связывания с рецептором IFN активирует сигнальный каскад, который в конечном итоге приводит к индукции транскрипции сотен критических противовирусных генов, включая IFN-индуцируемую протеинкиназу R, 2 ‘, 5’-олигоаденилатсинтетазы, TLR3, TLR7, и IRF7 (11, 35).Транскрипция IFN-α, которая в первую очередь регулируется IRF7, сильно активируется в результате усиления экспрессии гена IRF7. Впоследствии секретируемый IFN-α индуцирует еще один цикл передачи сигнала, опосредованного рецептором IFN, в качестве механизма положительной обратной связи.

Большинство вирусов разработали стратегии защиты от ответов хозяина IFN (13, 15). Эти стратегии включают ингибирование передачи сигналов IFN путем подавления базальных уровней сигнальной молекулы JAK-STAT, подавление определенных молекулярных модификаций и предотвращение молекулярной транслокации.Например, VP35 вируса Эбола отменяет продукцию IFN типа I, ингибируя активацию IRF3 (6, 7). В рамках вируса герпеса, ассоциированного с саркомой Капоши (KSHV), прототипа гамма-2 герпесвируса, открытая рамка считывания 45 (ORF45) кодирует белок, блокирующий продукцию IFN типа I путем ингибирования фосфорилирования и ядерной локализации IRF7 (40). Кроме того, недавно сообщалось, что KSHV vIRF3, называемый латентно-ассоциированным ядерным антигеном 2 (LANA2), значительно снижает выработку IFN типа I путем физического связывания с IRF7 (24).Вирус простого герпеса, прототип альфа-герпесвируса, кодирует по крайней мере два модулятора ответа IFN, US11 и ICP34.5, которые нацелены на аналогичный путь ответа IFN, путь двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы R (8-10, 31).

Вирус Эпштейна-Барра (EBV) — это повсеместный ДНК-вирус: им инфицировано 90% населения (25). После заражения вирус остается с хозяином до конца своей жизни. Первичная инфекция EBV приводит к инфекционному мононуклеозу, в то время как длительное воздействие EBV не имеет явных симптомов у иммунокомпетентного хозяина.Кроме того, ВЭБ ассоциируется с множеством опухолей, включая иммунобластную лимфому, болезнь Ходжкина, носоглоточную карциному, лимфому Беркитта и карциному желудка у пациентов со СПИДом с ослабленным иммунитетом и реципиентов трансплантатов органов при иммуносупрессивном лечении (25, 26). Это указывает на то, что ВЭБ находится под жестким контролем иммунной системы хозяина. Описаны два белка EBV, которые значительно подавляют адаптивные иммунные ответы (20, 34). EBV BGLF5 помогает вирусу избежать распознавания Т-клетками-хозяевами и уничтожения инфицированной клетки, отключая экспрессию генов главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и MHC класса II (34).BNLF2a, белок раннего литического цикла EBV, блокирует презентацию MHC класса I за счет инактивации пептидного транспортера TAP1 / TAP2 для нарушения ответа Т-клеток CD8 ⁺ (20). Недавно сообщалось, что EBV BZLF1 негативно регулирует IRF7, но механизм остается неясным (17). Несмотря на ее связь с различными проблемами здоровья человека, наши знания о стратегии уклонения от EBV против врожденного иммунитета хозяина, опосредованного IFN I типа, отсутствуют, особенно по сравнению с другими герпесвирусами.

Для поиска специфических генов EBV, которые блокируют передачу сигнала IFN, мы провели скрининг ORF для EBV на их способность блокировать IFN-α / β-опосредованную экспрессию люциферазы при вирусной инфекции.Для создания библиотеки экспрессии EBV 150 исходных клонов EBV были субклонированы в векторы-получатели pCR3-Flag-His ₆ с использованием системы Gateway. Каждый вирусный клон исследовали расщеплением рестриктазой и секвенированием ДНК, в то время как экспрессию вирусного белка определяли анализом иммуноблоттинга (данные не показаны). Чтобы идентифицировать белки EBV, которые ингибируют продукцию IFN типа I, клетки 293T трансфицировали IRF7, репортером люциферазы, управляемым промотором IFN-α6, и трансфекционным контрольным репортером люциферазы Renilla вместе с отдельными экспрессирующими клонами EBV, а затем инфицировали 50 гемагглютинирующими (НА) единицы вируса Сендай (SeV), мощный стимул выработки интерферона I типа.Через 24 часа после инфицирования клетки собирали для репортерных анализов. Вирус Эбола VP35, который, как было показано, блокирует передачу сигнала IFN (6, 7), был включен в качестве положительного контроля. Этот скрининг обнаружил, что EBV LF2 значительно ингибирует SeV-индуцированную активацию активности промотора IFN-α6. Чтобы определить, является ли ингибирующая способность LF2 общей или специфической для IRF7, мы протестировали его влияние на активацию промоторов IFN-α1, -4 и -6, которые регулируются в первую очередь клеточным IRF7 (11, 19, 22, 23). , 27, 35).Результаты показали, что в зависимости от дозировки экспрессия LF2 надежно подавляла IRF7-индуцированную активацию промоторных активностей IFN-α1, -4 и -6 (фиг. 1A). Чтобы дополнительно рассмотреть ингибирование активности промотора IFN с помощью LF2, мы измерили уровни мРНК IFN типа I в присутствии или в отсутствие экспрессии LF2. Через 24 часа после трансфекции с использованием IRF7, с EBV LF2 и без него, клетки 293T инфицировали SeV в течение 16 часов, а затем собирали для выделения общих РНК. ПЦР с обратной транскрипцией проводили с равными количествами тотальной РНК для определения уровней мРНК IFN I типа.После инфицирования SeV заметное увеличение мРНК IFN-α1, IFN-α4 и IFN-α6 было обнаружено в клетках, трансфицированных вектором IRF7, тогда как повышение было минимальным или не обнаруживалось в клетках, трансфицированных как IRF7, так и LF2 (рис. 1B). . Кроме того, иммуноферментный анализ показал, что подобно KSHV vIRF3, EBV LF2 эффективно подавлял секрецию IFN-α, вызванную инфекцией SeV (рис. 1C). Эти результаты показывают, что EBV LF2 эффективно блокирует опосредованную IRF7 активацию экспрессии IFN типа I.

В то время как IRF7 и IRF3 являются критическими регуляторами транскрипции экспрессии гена IFN типа I, IRF7 в первую очередь активирует активность промотора IFN-α1, -4, -6 и -14, а IRF3 индуцирует активность промотора ISRE (IFN-стимулированный чувствительный элемент) ( 11, 19, 22, 23, 35). Мы исследовали, отменяет ли экспрессия LF2 индуцированную IRF3 активацию активности промотора ISRE. Через 24 часа после трансфекции репортером люциферазы, управляемым промотором ISRE, с увеличивающимся количеством LF2, клетки 293T инфицировали SeV в течение 12 часов, а затем собирали для анализа люциферазы.Результаты показали, что, в отличие от его надежного аннулирования транскрипционной активности IRF7, LF2 не обнаруживает эффекта на IRF3-индуцированную активацию активности промотора ISRE (Рис. 1D). Напротив, VP35 вируса Эбола значительно подавлял индуцированную вирусом активность промотора ISRE в тех же условиях (рис. 1D). Эти результаты предполагают, что EBV LF2 специфически ингибирует активность IRF7, но не IRF3.

Учитывая ингибирующий эффект EBV LF2 на транскрипцию, индуцированную IRF7, мы протестировали потенциальное взаимодействие LF2 с IRF7.Через 48 часов после трансфекции экспрессионными векторами IRF7 и Flag-tagged LF2 или Flag-tagged IRF7 и V5-tagged LF2 экспрессирующие векторы клетки 293T использовали для иммунопреципитации (IP) с антителом против Flag с последующим иммуноблоттингом с анти-IRF7 или анти-IRF7 -V5 антитела соответственно. Co-IPs показали эффективное взаимодействие между LF2 и IRF7 (рис. 2A и B). Несмотря на высокую степень сходства с IRF7, IRF3 не способен связываться с LF2 в тех же условиях (рис. 2C). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что LF2 специфически взаимодействует с IRF7, но не с IRF3, и это взаимодействие, скорее всего, объясняет способность LF2 блокировать опосредованную IRF7 активацию экспрессии IFN типа I.

При вирусной инфекции IRF7 подвергается индуцированному инфекцией фосфорилированию серина в пределах своего карбоксиконцевого регуляторного домена. Эта модификация впоследствии стимулирует димеризацию белка, удерживание в ядре и взаимодействие с транскрипционными коактиваторами, что приводит к активации устойчивого ответа, состоящего из широкого спектра изотипов IFN (28, 30). Как было показано ранее (12, 16, 36), экспрессия киназ TBK1 и IKKε, которые фосфорилируют карбоксиконцевой регуляторный домен IRF7, приводит к активации транскрипционной активности IRF7, что приводит к резкому увеличению активности промотора IFN-α4 ( Инжир.3А). Однако коэкспрессия LF2 эффективно подавляла опосредованную TBK1 или IKKε киназой активацию транскрипционной активности IRF7 (фиг. 3A). В этих условиях коэкспрессия IKKε или TBK приводит к почти полному сдвигу IRF7 в его медленно мигрирующую фосфорилированную форму во время электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (фиг. 3B). Мы обнаружили, что LF2 не влияет на TBK- или IKKε-опосредованную задержку миграции IRF7 (фиг. 3B). Было показано, что мутация C-концевых 477 и 479 остатков серина IRF7 в отрицательно заряженную глутаминовую кислоту, называемая IRF7 S477D S479D, имитирует TBK- или IKKε-опосредованное фосфорилирование, что приводит к конститутивной активации транскрипционной активности IRF7 (28, 30, 39).LF2 подавлял зависимым от дозы образом транскрипционную активность IRF7 S477D S479D так же эффективно, как и активность IRF7 дикого типа (фиг. 3C). Более того, LF2 не влияет на ядерную транслокацию IR7, потому что LF2 также локализуется в ядре (Fig. 4). Наконец, несмотря на то, что IRF7 подвергается протеосомному пути деградации (38), экспрессия LF2 не влияет на уровни белка IRF7 на детектируемом уровне (рис. 5). Эти результаты в совокупности указывают на то, что взаимодействие LF2 не влияет на фосфорилирование IRF7 и стабильность белка.

IRF7 состоит из N-концевого повтора триптофана, содержащего DBD, домен трансактивации, IAD и C-концевой регуляторный домен (RD) (28, 30, 39). Вызванное вирусом фосфорилирование IRF7, по-видимому, ослабляет внутримолекулярную ассоциацию между двумя аутоингибиторными доменами и демаскирует N-концевой DBD и C-концевой IAD, что приводит к образованию гомодимеров через IAD. Димеры IRF7 впоследствии перемещаются из цитоплазмы в ядро ​​и стимулируют связывание ДНК и транскрипционную активность (28, 30, 39).Чтобы проверить, блокирует ли взаимодействие LF2 димеризацию IRF7, слияние глутатион S -трансфераза (GST) -IRF7 и белки Flag-IRF7 были коэкспрессированы в клетках 293T вместе с увеличивающимися количествами V5-LF2. Анализ GST pull-down показал, что гомодимеризация GST-IRF7 и Flag-IRF7, по-видимому, снижалась при экспрессии LF2, в то время как взаимодействие GST-IRF7 и V5-LF2 увеличивалось в тех же условиях (фиг. 6A). Клетки трансфицировали вектором экспрессии V5-LF2 и слияниями GST-IRF7, содержащими DBD, домен активации (AD), IAD, RD или полноразмерный ген, с последующим удалением GST.Анализ методом pull-down показал, что меченый V5 LF2 эффективно взаимодействует с полноразмерными GST-IRF7 и GST-IAD, но не с GST, GST-DBD, GST-AD и GST-RD (фиг. 6B). Эти результаты показывают, что LF2 эффективно ингибирует димеризацию IRF7, взаимодействуя с IAD IRF7, что может объяснять нарушение транскрипции, индуцированной IRF7.

IRF7 является главным регулятором врожденного иммунитета, а также играет важную роль в переходе от врожденного иммунитета к приобретенному (22). Из-за своей важной роли в иммунитете хозяина многие вирусы разработали различные стратегии подавления активации IRF7.ICP0, кодируемый вирусом простого герпеса и вирусом герпеса 1 крупного рогатого скота, ингибирует фосфорилирование TBK1 и IKKε (29). В ответ на вирусную инфекцию, предранний литический белок KSHV, кодируемый ORF45, который представляет собой белок тегумента вириона, связывается с IRF7 и блокирует его фосфорилирование и накопление в ядре, что приводит к блокированию транскрипции IFN-α и IFN-β (40 ). Кроме того, ранний литический фактор ядерной транскрипции KSHV RTA действует как убиквитин E3 лигаза, способствуя убиквитинизации и деградации белка IRF7 протеасомозависимым образом (38).Кроме того, недавно было показано, что KSHV vIRF3 связывает IRF7, что подавляет ДНК-связывающую способность IRF7 (24). Наше настоящее исследование добавляет EBV LF2 к расширяющемуся семейству вирусных белков, которые ингибируют клеточную транскрипционную активность IRF7 посредством белок-белковых взаимодействий.

Кодируемая EBV нуклеотидогидролаза dUTP (dUTPase), как недавно сообщалось, индуцирует иммунную дисрегуляцию in vivo у мышей (14). EBV LF1 (ORF10) и LF2 (ORF11) оба содержат dUTPase-подобный домен, что предполагает потенциальную роль dUTPase-подобного домена для активности против IFN.Однако наше предварительное исследование показало, что dUTPase-подобный домен не требуется для ингибирования продукции IFN типа I с помощью LF2 (неопубликованные данные). Кроме того, EBV LF1 и LF2, по-видимому, не важны для вирусной репликации в культуре клеток, поскольку геномная область, содержащая эти последовательности, удалена из штамма EBV B95-8, часто используемого для изучения вирусной репликации и иммортализации. Кроме того, мы также обнаружили, что ген LF2 лимфокриптовируса резуса, вируса, наиболее близкого к EBV (32, 37), эффективно подавляет индуцированную IRF7 транскрипцию IFN типа I, предполагая генетическую и функциональную консервацию LF2 в этих двух вирусах (неопубликованные данные). данные).Конструирование LF2-нокаутного лимфокриптовируса-резуса может быть полезным для выяснения функционального значения LF2 как антагониста IFN типа I, таким образом обеспечивая лучшее понимание того, вносит ли и как LF2 вклад в успешную инфекцию EBV и патогенез in vivo.