Ифнс выписка онлайн: Предоставление сведений из ЕГРЮЛ/ЕГРИП

Выписка из EГPЮЛ упрощает и ускоряет работы с документооборотом, проведение торгов или финансовых операций. Документ выдается в документальном виде на платной основе и в электронной форме на бесплатной основе. Срок ожидания выписки — от 5 дней. Получить выписку можно за юридическое лицо, подав заявление и оплатив пошлину. Проверку подлинности данных в документе можно провести, установив и настроив соответствующее ПО. В случае неполных или неверных данных выдается справка об ошибке.

А если данные о юридическом лице вымышленные?

Может случиться и так, что вами будет введена неверная информация или переданы для проверки ошибочные сведения. В этом случае будет выдана справка «Об отсутствии запрашиваемой информации».

Что делать, если электронную выписку не принимают?

Если вам отказали в приеме электронной выписки, придется получить бумажный вариант. Для этого необходимо оплатить госпошлину через платежный терминал. Квитанцию распечатать и сохранить. Обратиться в налоговую или МФЦ для формирования запроса.

Получить бумажную выписку из ЕГРЮЛ можно лично (доверенным представителям юрлица, если выписка расширенная) или через посредника (также по доверенности), который не только получит, но и принесет документ в назначенное место, например, в банк.

Что говорит закон о выписке ЕГРЮЛ с ЭЦП?

Согласно ст. 6 Федерального закона от 08.08.2001 N 129-ФЗ сведения об организациях предоставляются в т.ч. путем формирования выписки из реестра. Порядок такого предоставления урегулирован в специализированном регламенте (утв. Приказом Минфина от 15.01.2015 N 5н).

Проставление ЭЦП на подобной информации регламентировано Федеральным законом от 06.04.2011 N 63-ФЗ.

Признаки используемых для этих целей подписей таковы:

• применение ключа подписи;
• возможность идентифицировать человека, подписавшего документ;
• с ее помощью можно отследить изменения в электронном документе;
• ключ проверки КЭП прописывается в специальном сертификате;
• для КЭП применяются специальные средства, соответствующие отдельным требованиям законодательства.

Согласно ст. 6 Закона от 06.04.2011 N 63-ФЗ документ в электронной форме, закрепленный КЭЦП, равнозначен бумажной форме документации, подписанной вручную. Такой документ (в т.ч. выписка из ЕГРЮЛ с усиленной электронной подписью) может быть использован в любых правоотношениях, если иное не предусмотрено отечественным законодательством.

На равнозначность подобной документации указало Минэкономразвития в письме от 01.12.2015 N Д28и-3448, рассматривая вопрос о возможности представления для участия в запросе котировок выписки из ЕГРЮЛ с ЭЦП налоговой. Предоставление содержащихся в ЕГРЮЛ сведений различным органам власти и судам сопровождается подписанием усиленной КЭЦП соответствующей выписки.

В качестве дополнительной информации сообщаем, что для обратного взаимодействия с налоговиками, таможенными органами, а также в целях подписания электронных счетов-фактур субъектами предпринимательства тоже применяется квалифицированная электронная подпись. Для подписания же первичных бухгалтерских документов могут применяться и КЭЦП, и неквалифицированная подпись, и даже простая ЭЦП. При этом все эти средства должны противостоять угрозам, направленным на нарушение безопасности информации, защищаемой ЭЦП.

Из п. 3 Постановления Пленума ВАС РФ от 17.02.2011 N 12 следует, что такая выписка может служить документом, подтверждающим информацию о месте нахождения истца и ответчика для целей арбитражного процесса. Для того чтобы получить выписку с информацией об организации, следует в поисковой строке специализированного портала на сайте ФНС указать ОГРН или ИНН соответствующего лица. Также возможно осуществить поиск и при помощи указания наименования организации и территории ее нахождения.

Преимущества электронной выписки перед бумажной:

Не требуется личное
посещение и стояние в
очередях

Экономия времени. С момента
заявки до получения
бумажного варианта пройдет 5
дней, при онлайн-заявке
запрос будет выполнен уже на
следующий день

В отличие от бумажного
документа электронная
 выписка с ЭЦП налоговой
 бесплатная

К недостаткам стоит отнести лишь то, что пока не везде принимают электронный вариант.

Где получить ЭЦП?

Чтобы упростить работу и взаимодействие со многими учреждениями и коммерческими организациями, стоит приобрести электронно-цифровую подпись. Выдают ЭЦП только авторизированные удостоверяющие центры, входящие в официальный список.

За получением ЭЦП вы можете обратиться и в наш Удостоверяющий центр.

Выписка ЕГРИП | Контур.Фокус

Сервис Контур.Фокус позволяет в один клик получить свежую выписку из Единого государственного реестра индивидуальных предпринимателей (ЕГРИП). Выписка из ЕГРИП может быть полезной при подтверждении должной осмотрительности в выборе потенциального контрагента в случае возникновения спорных моментов. Рекомендуется дополнительно воспользоваться такими возможностями как арбитражная практика, залоги движимого имущества, статистика платежей. Такая предусмотрительность поможет сократить риск заключения договора с ненадёжным партнёром.

Структура выписки ЕГРИП

Выписка из ЕГРИП состоит из разделов:

1. Основные сведения
   ОГРНИП, ИНН, ФИО, статус.
2. Регистрационные данные
   Сведения о статусе ИП, вид предпринимателя (ИП, глава КФХ), в какой инспекции состоит на учете сейчас.
3. Паспортные данные, указываются для гражданина РФ; для иностранца и лица без гражданства указывается вид и данные документа, удостоверяющего личность; для лиц без гражданства данные документа о праве временного или постоянного проживания.
4. Сведения, идентифицирующие ФЛ
   ФИО, ФИО латиницей (для иностранцев), пол.
5. Сведения о гражданстве
   Гражданство РФ, иностранное гражданство или лицо без гражданства.
6. Сведения о видах экономической деятельности
   Основной и дополнительные виды деятельности с указанием кода ОКВЭД и расшифровкой кода.
7. Сведения о постановке на учет в налоговом органе
   В какой налоговой и с какого момента предприниматель стоит сейчас на учёте.
8. Сведения о прекращении деятельности. Указывается дата и способ (добровольно, в связи со смертью, по решению суда).
9. Сведения о регистрации в ПФ России
   Регистрационный номер в территориальном органе Пенсионного Фонда, дата постановки на учёт (снятия).
10. Сведения о регистрации в ФСС России
    Регистрационный номер в территориальном исполнительном органе ФСС, дата регистрации в фонде, ФСС.
11. Сведения о лицензиях
    Если предприниматель имеет лицензии, то указывается номер лицензии, лицензирующий орган, предмет лицензии, дата выдачи и срок действия.
12. Сведения о записях в ЕГРИП
    В разделе зафиксированы все регистрационные действия предпринимателя. По каждому действию указана ГРН (государственный рег.номер события), дата, тип события, код налоговой, где происходила его регистрация. Тип события описан очень кратко – например, это внесение изменений, связанное либо не связанное с изменением в учредительных документах.
13. Сведения о выданных свидетельствах
    Указаны серия, номера и даты выдачи свидетельств о внесении изменений.

Статусы предпринимателя

Предприниматель может иметь один из перечисленных ниже статусов (1 и 2 раздел выписки):

• Действующее
• Индивидуальный предприниматель прекратил деятельность в связи с принятием им соответствующего решения
• Утратил государственную регистрацию в качестве индивидуального предпринимателя на основании статьи 3 ФЗ от 23.06.2003 №76-ФЗ
• Крестьянское (фермерское) хозяйство прекратило деятельность на основании единогласного решения членов крестьянского (фермерского) хозяйства
• …

Ограничения на предоставление информации

Доступ к перечисленной ниже информации НЕ может быть предоставлен:

• паспортные данные физического лица: пол, дата рождения, адрес, номер паспорта
• сведения о банковских счетах

Выписка из ЕГРИП в Контур.Фокус

Формирование выписки из ЕГРИП с подписью ФНС или на конкретную дату, является важной возможностью Контур.Фокус. Наличие у заказчика подобных сведений позволят сделать объективный выбор поставщика продукции, работ или услуг.

Запрос выписки

На вкладке «Сводка» внизу страницы слева имеется отдельный блок «Выписка из ЕГРИП», позволяющий получить нужные сведения.

Блок “Выписка из ЕГРИП”

Сформировать сведения можно на любую дату начиная с 2016 года.

Выписка из ЕГРИП на определённую дату

После выбора даты следует кликнуть «Сформировать», и пользователь получит выписку в формате .pdf. Полученные сведения носят ознакомительный характер.

Выписка ЕГРИП на 11.01.2016

Запрос выписки ЕГРИП, заверенной ФНС

Если же необходимо получить официальный документ, то нужно кликнуть «Запросить с подписью ФНС».

Запрос выписки с подписью ФНС

Информация формируется на текущую дату и заверена усиленной квалифицированной электронной подписью ФНС.

Выписка ЕГРИП лист 1-2

Выписка ЕГРИП лист 3-4

Отображение документов о планируемом внесении изменений в ЕГРИП

С целью более подробного ознакомления с записями в ЕГРИП доступен блока «Документы на внесение изменений в ЕГРИП», в котором представлены сведения о предстоящих изменениях в реестре. Они помогут узнать, например, о предстоящей ликвидации или смене деятельности.

Блок “Документы на внесение изменений в ЕГРИП”

Для просмотра полного списка документов, находящихся на рассмотрении в ФНС, нужно кликнуть «Подробнее».

Карточка предстоящих записей ЕГРИП

В сформированной карточке в отношении каждого обращения имеются такие сведения как:

• дата обращения с указанием типа заявления
• входящий номер, который присваивается в налоговой инспекции
• ИФНС, с указанием номера и наименования территориального подразделения
• форма заявления, а именно на бланке какого образца подавалось заявление, например, Р24001
• готовность документа, дата соответствующего решения
• вид решения, отказ либо регистрация

Записи в ЕГРИП

В блоке «Записи в ЕГРИП» содержится информация о последних внесённых изменениях в ЕГРИП.

Блок “Записи в ЕГРИП”

Оранжевым цветом могут быть выделены записи, в отношении которых ФНС ещё не приняла решения (на это инспекции отводится 6 рабочих дней) либо был оформлен отказ.

Если кликнуть «Подробнее» появится полный список записей.

Список карточек по внесённым записям в ЕГРИП

Для каждой записи сформирована индивидуальная карточка, структура которой может отличаться в зависимости от её характера. Так предусмотрены следующие поля:

• дата и содержание записи
• документы, которые предоставлялись при обращении в налоговую инспекцию
• регорган, номер и наименование территориального органа ИФНС
• ГРН, государственный регистрационный номер, присвоенный записи
• свидетельство, указывается номер при обращении за регистрацией

Выписка из ЕГРИП является весьма полезной, поскольку с её помощью можно отследить предстоящие изменения в работе потенциального контрагента, заблаговременно узнать о предстоящей ликвидации или закрытии ИП. Подобные сведения помогут исключить заключения изначально неисполняемых договоров. Пользователю системы Контур.Фокус доступны для ознакомления следующие возможности: бухгалтерская отчётность, лицензии, место в отрасли, реестр МСП.

Источник информации

Сведения, содержащиеся в выписках ЕГРИП, берутся с официального источника – базы данных Федеральной налоговой службы.

Периодичность обновления

Сверка информации, имеющейся в распоряжении веб-сервиса Контур.Фокус, происходит ежедневно с данными Федеральной налоговой службы, за счёт этого гарантируется актуальность предоставляемых сведений.

Доступно на тарифах

Заявка на Контур.Фокус

Заполните все поля заявки, наши специалисты в самок ближайшее время свяжутся с Вами, проведут онлайн презентацию сервиса и помогут выбрать подходящий тариф:

Предоставление выписки из Единого государственного реестра налогоплательщиков (ЕГРН) В избранное

Обжалование решений и (или) действий (бездействия) налоговых органов и (или) их должностных лиц при предоставлении государственной услуги, рассмотрение соответствующих жалоб и принятие решений по ним осуществляются в порядке, установленном разделом VII Налогового кодекса Российской Федерации.

Предметом жалобы являются решение, действие (бездействие) налогового органа, его должностных лиц при предоставлении государственной услуги (жалоба), которые, по мнению заявителя, нарушают его права и законные интересы.

Жалоба может быть направлена вышестоящему налоговому органу в соответствии со статьями 138 и 139 Налогового кодекса Российской Федерации.

Жалоба подается и подлежит рассмотрению (оставляется без рассмотрения) в соответствии со статьями 138, 139, 139.2 —140 Налогового кодекса Российской Федерации.

Жалоба подлежит рассмотрению в сроки, предусмотренные статьей 140 Налогового кодекса Российской Федерации.

Основания для приостановления рассмотрения жалобы отсутствуют.

По результатам рассмотрения жалобы вышестоящим налоговым органом, рассматривающим жалобу, принимается решение в соответствии с пунктом 3 статьи 140 Налогового кодекса Российской Федерации.

Решение о результатах рассмотрения жалобы вручается (направляется) заявителю, подавшему эту жалобу, в соответствии с пунктом 6 статьи 140 Налогового кодекса Российской Федерации.

Решение по жалобе вручается (направляется) заявителю в письменной форме или по просьбе заявителя в электронной форме.

Решение по жалобе может быть обжаловано в порядке, предусмотренном пунктом 2 статьи 138 Налогового кодекса Российской Федерации.

Право заявителя на получение информации и документов, необходимых для обоснования и рассмотрения жалобы, осуществляется в соответствии с Налоговым кодексом Российской Федерации.

Информирование заявителей о порядке подачи и рассмотрения жалобы осуществляется в соответствии с пунктом 12 административного регламента.

ФНС запустила бесплатный сервис для отслеживания изменений в данных о компаниях Статьи редакции

Можно подписаться на информацию о компании и получать уведомления, если она изменит адрес, директора или учредителей.

• Сервис заметило издание «Тинькофф-журнал». С его помощью можно узнать об обращениях нужной компании или ИП в налоговую: например, чтобы изменить в госреестре данные об адресе, директоре или составе учредителей.
• Чтобы воспользоваться системой, нужно зарегистрироваться на сайте налоговой и указать почту, куда будут приходить уведомления. Для подписки на информацию о компании или ИП нужно знать её ОГРН или ОГРНИП. По ИНН и названию компании искать нельзя, уточнили в «Тинькофф-журнале».

• Этот сервис можно использовать для проверки контрагентов, слежения за изменениями в бизнесе собственных компаний и в других случаях — он бесплатный.

13 692 просмотров

{ «author_name»: «Лера Михайлова», «author_type»: «editor», «tags»: [«\u043d\u043e\u0432\u043e\u0441\u0442\u044c»,»\u043d\u043e\u0432\u043e\u0441\u0442\u0438″,»\u0438\u043d\u0441\u0442\u0440\u0443\u043c\u0435\u043d\u0442\u044b»], «comments»: 23, «likes»: 33, «favorites»: 60, «is_advertisement»: false, «subsite_label»: «finance», «id»: 51668, «is_wide»: true, «is_ugc»: false, «date»: «Fri, 23 Nov 2018 19:00:26 +0300», «is_special»: false }

{«id»:78969,»url»:»https:\/\/vc.ru\/u\/78969-lera-mihaylova»,»name»:»\u041b\u0435\u0440\u0430 \u041c\u0438\u0445\u0430\u0439\u043b\u043e\u0432\u0430″,»avatar»:»84516d92-b701-d03f-a7c7-e52be4c7a9df»,»karma»:89397,»description»:»»,»isMe»:false,»isPlus»:true,»isVerified»:false,»isSubscribed»:false,»isNotificationsEnabled»:false,»isShowMessengerButton»:false}

{«url»:»https:\/\/booster.osnova.io\/a\/relevant?site=vc»,»place»:»entry»,»site»:»vc»,»settings»:{«modes»:{«externalLink»:{«buttonLabels»:[«\u0423\u0437\u043d\u0430\u0442\u044c»,»\u0427\u0438\u0442\u0430\u0442\u044c»,»\u041d\u0430\u0447\u0430\u0442\u044c»,»\u0417\u0430\u043a\u0430\u0437\u0430\u0442\u044c»,»\u041a\u0443\u043f\u0438\u0442\u044c»,»\u041f\u043e\u043b\u0443\u0447\u0438\u0442\u044c»,»\u0421\u043a\u0430\u0447\u0430\u0442\u044c»,»\u041f\u0435\u0440\u0435\u0439\u0442\u0438″]}},»deviceList»:{«desktop»:»\u0414\u0435\u0441\u043a\u0442\u043e\u043f»,»smartphone»:»\u0421\u043c\u0430\u0440\u0442\u0444\u043e\u043d\u044b»,»tablet»:»\u041f\u043b\u0430\u043d\u0448\u0435\u0442\u044b»}},»isModerator»:false}

Как заказать выписку из ЕГРЮЛ в СБИС

Белостоцкая Наталья

эксперт по работе с программами отчетности

~ 1 мин на чтение
Нет времени читать?

Узнайте, как заказать выписку в ЕГРЮЛ через СБИС — инструкция.

Заказываем выписку ЕГРЮЛ из СБИС

Из отчета ЕГРЮЛ можно узнать регистрационные данные юридического лица, дату регистрации, руководителя и учредителей компании.

Существует 4 вида выписок:Электронная — содержит общие сведения о юридическом лице, которые находятся в открытом доступе. Получить такую выписку может кто угодно, но использовать её в качестве документа нельзя.

• Обычная — выдается по любому запросу и не содержит контактов, паспортных данных учредителей и банковских реквизитов.
• Расширенная — выдается только юридическому лицу при его регистрации.
• Официальная — с печатью ФНС, содержит все сведения о юрлице

Выписка заверенная электронной подписью ФНС

Выписка полученная из ЕГРЮЛ поможет выбрать надежного контрагента. С использованием сервиса СБИС документ можно заказать онлайн.

Документ заверенный ЭП из налоговой наделена юридической силой. Равнозначна бумажному документу с подписью ФНС. Запросив такой документ вы обезопасите свою компанию и исключите риски.

Получаем выписку из ЕГРЮЛ в СБИС — инструкция

Для получения нужно знать ИНН организации. В правой колонке выберите кнопку «Компании», после чего введите в поле ИНН интересующей вас организации и нажмите кнопку «Найти».

В открывшейся карточке вы найдете: ОКВЭД организации, данные о руководителе, количество сотрудников, выручку, стоимость бизнеса, контактные данные и так далее.

Ссылка на выписку находится в правом нижнем углу карточки контрагента, сразу после перечня сведений об организации. Там же находится и ссылка из федеральной службы государственной статистики. Полный текст выписки из ЕГРЮЛ доступен в СБИС только после покупки блока «Всё о компаниях ».

ГК “ЛАД” — уполномоченный представитель Удостоверяющего центра «Тензор», аккредитованного Минкомсвязи. ЭП предоставит ряд возможностей в службах, где требуется электронное удостоверение личности.

Наши менеджеры ответят на вопросы и проконсультируют вас. Обращайтесь!

С 1 июля 2020 года ФНС контролирует доходы россиян

Социальные сети и некоторые СМИ вновь пугают налогоплательщиков, распространяя информацию о том, что якобы с 1 июля 2020 года вступят в силу указания (без уточнения каких-либо реквизитов), согласно которым все банки будут в течение трех дней предоставлять налоговым органам данные обо всех операциях физических лиц по счетам и вкладам.

Соответственно, объявляется, что налоговые органы получат полный доступ к сведениям о всех счетах физических лиц, а при обнаружении невыясненных поступлений инспекторы будут вызывать налогоплательщиков на допрос, а потом начислять НДФЛ, пени и штрафы на эти невыясненные платежи.

Обращаем ваше внимание, что с 1 июля 2020 года каких-либо изменений в этой сфере пока не планируется, а указанная выше информация периодически тиражируется в интернете еще с 2018 года.

Ранее ФНС поясняла, что с 1 сентября 2016 года подпункт 1.1 статьи 86 НК РФ обязал банки сообщать в налоговые органы об открытии/закрытии счетов физических лиц. При этом те же формулировки, но в другом пункте, существовали в НК РФ с 1 июля 2014 года. Это значит, что доступ к информации о счетах граждан у налоговых органов есть уже почти 6 лет. С 1 июня 2018 года банки по запросам налоговых органов также обязаны предоставлять справки по счетам физлиц в драгоценных металлах.

Таким образом, все те обязанности банков, которые по сообщениям в социальных сетях и ряде СМИ должны вступить в силу с 1 июля 2020 года, уже давно действуют.

Но, как уже уточняла ФНС , запросить информацию о счетах, вкладах и электронных кошельках налоговые органы могут только при проведении проверок в отношении конкретного физического лица. Например, если гражданин направил заявление о получении налогового вычета за покупку квартиры, не имея официального дохода. В этом случае налоговая может заинтересоваться поступлениями на счета налогоплательщика. 

При этом такие сведения налоговые органы могут запросить при согласии руководителя УФНС по субъекту РФ или руководства ФНС России.

Страшилки о тотальном контроле всех поступлений, включая мелкие, — не более, чем фейковая информация, распространяемая недобросовестными сайтами и гражданами для повышения своей популярности. 

БУХПРОСВЕТ

По закону все без исключения банки обязаны сообщать в ИФНС по месту своего нахождения об открытии/закрытии счетов и вкладов организации, ИП и физлица. Также банки сообщают о предоставлении права или прекращении права организации и ИП использовать корпоративные электронные средства платежа для переводов электронных денежных средств, а также об изменении реквизитов корпоративных счетов.

Информация сообщается в электронной форме в течение трех дней со дня соответствующего события. Для этого никакого требования со стороны ИФНС не требуется. Банки обязаны выдавать ИФНС справки о наличии счетов и вкладов и об остатках денежных средств на них в течение трех дней со дня получения мотивированного запроса налогового органа. Предоставлять информацию о счетах и вкладах обязаны даже те банки, у которых была отозвана лицензия на осуществление банковских операций. Информация предоставляется до дня внесения в ЕГРЮЛ записи о ликвидации банка.

Справки о наличии счетов, вкладов и об остатках денежных средств, выписки по операциям могут быть запрошены налоговыми органами в случаях проведения налоговых проверок, а также в случаях вынесения решения о взыскании налога, принятия решений о приостановлении операций по счетам.

IFN-ε постоянно экспрессируется клетками репродуктивного тракта и неэффективно секретируется фибробластами и клеточными линиями

Abstract

Интерфероны типа I (IFN) образуют большое семейство цитокинов, которые в первую очередь действуют для контроля раннего развития вирусных инфекций. Типичные гены IFN типа I, такие как гены, кодирующие IFN-α или IFN-β, активируются вирусной инфекцией во многих типах клеток. Напротив, сообщалось, что ген, кодирующий IFN-ε, конститутивно экспрессируется клетками женского репродуктивного тракта и вносит вклад в защиту от вагинальных инфекций, вызванных вирусом простого герпеса 2 и Chlamydia muridarum .Наши данные подтверждают отсутствие индукции экспрессии IFN-ε после вирусной инфекции и конститутивную экспрессию IFN-ε клетками женских, но также и мужских репродуктивных органов. Интересно, что при экспрессии из трансфицированных экспрессионных плазмид в клетках 293T, HeLa или Neuro2A, мышиные и человеческие предшественники IFN-ε подвергались неэффективному процессингу, а секреция IFN-ε была минимальной. Анализ химерных конструкций, полученных между IFN-ε и лимитином (IFN-ζ), показал, что как сигнальный пептид, так и зрелая часть IFN-ε вносят вклад в плохой процессинг предшественника.Иммунофлуоресцентное обнаружение IFN-ε, меченного FLAG, в трансфицированных клетках позволило предположить, что IFN-ε и химерные белки не способны прогрессировать по секреторному пути. IFN-ε, однако, не действовал внутриклеточно и не сообщал продуцирующим клеткам антивирусное состояние. Учитывая конститутивную экспрессию IFN-ε в специализированных клетках и плохую обработку предшественника IFN-ε в фибробластах и ​​клеточных линиях, мы предполагаем, что для секреции IFN-ε может потребоваться кофактор, специфически экспрессируемый в клетках репродуктивных органов, который может защитить систему от аномального высвобождения этого IFN.

Образец цитирования: Hermant P, Francius C, Clotman F, Michiels T (2013) IFN-ε конститутивно экспрессируется клетками репродуктивного тракта и неэффективно секретируется фибробластами и клеточными линиями. PLoS ONE 8 (8): e71320. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071320

Редактор: Фолькер Тиль, Кантональная больница Санкт-Галлен, Швейцария

Поступила: 30 мая 2013 г .; Дата принятия: 3 июля 2013 г .; Опубликован: 9 августа 2013 г.

Авторские права: © 2013 Hermant et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: PH был научным сотрудником Католического университета Лувена (UCL). Эта работа была поддержана Национальным фондом научных исследований (FNRS-FRSM) и Межвузовской программой полюсов притяжения, инициированной Бельгийским бюро научной политики (PAI-P7 / 45 BELVIR).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Интерфероны типа I (IFN) представляют собой семейство цитокинов, наделенных сильной противовирусной активностью [1]. Члены этого семейства, также называемые IFN-α / β, включают IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ω, IFN-τ (овцы и крупный рогатый скот) и IFN-ζ или лимитин ( мышей).Сообщается, что IFN типа I связываются с общим гетеродимерным рецептором (IFNAR) [2], тем самым вызывая каскад передачи сигнала, ведущий к активации транскрипции сотен стимулированных интерфероном генов (ISG), которые вносят вклад в противовирусную активность [3-5].

Ген, кодирующий IFN-ε, был идентифицирован как типичный, единственный безинтронный ген IFN типа I, отображаемый на локус IFN хромосомы 9 человека или хромосомы 4 мыши [6,7]. Хотя недавний генетический анализ выявил частые полиморфизмы в гене IFNE человека [8], этот ген хорошо сохраняется у млекопитающих [6,9,10].Было показано, что IFN-ε человека может связываться с рецептором IFN типа I (IFNAR) [11] и обладает некоторой противовирусной активностью [9,12,13].

Интересно, что недавнее исследование Fung et al. сообщает, что, в отличие от других охарактеризованных генов IFN типа I, ген, кодирующий IFN-ε, не подвергался усилению транскрипции при обработке клеток синтетическими лигандами, которые активируют другие гены IFN типа I. Вместо этого IFN-ε экспрессировался тканеспецифическим образом эптителиальными клетками женского репродуктивного тракта.IFN-ε индуцировался введением эстрогена, варьировал в зависимости от эстрального цикла и подавлялся во время беременности. Важно отметить, что мыши с дефицитом Ifne имели повышенную восприимчивость к вагинальной инфекции вирусом простого герпеса 2 и Chlamydia muridarum [10].

В этой работе мы подтверждаем конститутивную экспрессию IFN-ε клетками женских, а также мужских репродуктивных органов. Мы показываем, что созревание и секреция IFN-ε неэффективны в клеточных линиях и фибробластах, и поэтому мы предполагаем, что секреция IFN-ε клетками репродуктивных органов включает специфический кофактор, отсутствующий в других клетках.

Материалы и методы

Эксперименты на животных

: Работа с мышами (соглашение LA1230472) и экспериментальные процедуры проводились в соответствии с директивой EEC 86/609 / CEE и соответствующим бельгийским законом от 6 апреля 2010 г. Исследование и протокол, использованные в этом исследовании, были одобрены комитет Лувенского университета в соответствии с соглашением № 2010 / UCL / MD / 031.

Клетки, трансфекции, лечение клеток

Клеточные линии, использованные в этом исследовании, были человеческими линиями 293T (любезно предоставлены F.Tangy, Институт Пастера, Париж) [14] и эпителиальные клетки HeLa (ATCC), нейробластома мыши Neuro2A (ECACC) и фибробласты BALB / 3T3 (любезно предоставлены Francis Brasseur, Институт исследования рака Людвига, Брюссель) [15]. Клетки выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Lonza ref 12-604F), содержащей ультраглутамин и 4,5 г / л глюкозы, с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Sigma) и 50 единиц / мл пенициллина / стрептомицина (Lonza ). Эмбриональные фибробласты мыши (MEF) выделяли от мышей C57BL / 6 стандартными процедурами.Вкратце, эмбрионы собирали на 14,5-й день беременности. Голова, сердце, печень, кишечник и почки были удалены, а оставшаяся часть эмбриона была помещена в чашку Петри, содержащую трипсин-ЭДТА (Lonza, 170000 Ед / л, трипсин, 200 мг / л ЭДТА), в которой была измельчена ткань. . После 13 минут инкубации при 37 ° C ткань гомогенизировали пипетированием и центрифугировали для удаления недиссоциированных фрагментов ткани. Затем клетки выращивали в среде DMEM с добавлением, как указано выше. Затем MEF были иммортализованы путем трансдукции pPH51, ретровирусного вектора, полученного из pQCXIN (Stratagene) и экспрессирующего большой Т-антиген обезьяньего вируса 40.Бессмертные MEF были названы MEF / T.

Трансфекцию клеток проводили с использованием реагента LT1 (Mirus) в соответствии с инструкциями производителя. Для лечения Брефельдином A GolgiPlug (ref 555029, BD Biosciences) разводили в 1000 раз культуральной средой. Анализ снижения цитопатического эффекта IFN проводили, как описано в [16]. Относительную противовирусную активность рассчитывали как наивысший фактор разведения образца, который защитил более 50% клеток от инфекции вирусом Менго.Значения относятся к значениям, полученным для культуральной среды.

Вирусы и инфекции

KJ7 представляет собой вирус, полученный из штамма DA1 вируса мышиного энцефаломиелита Тейлера (TMEV). В этом вирусе кодирующая область зеленого флуоресцентного белка (GFP) заменяет кодоны с 5 по 67 кодирующей последовательности лидерного белка. Вирус Менго (штамм вируса энцефаломиокардита — EMCV), используемый в этом исследовании, представляет собой ослабленный вариант, несущий укороченный тракт polyC (24 C) в его 5′-некодирующей области.Этот вирус был получен, как описано ранее [17], из плазмиды pMC24, несущей полноразмерный геном вируса, клонированной как кДНК [18]. Трех шестинедельных самцов мышей C57BL / 6 Mx1 ^{+ / +} внутрибрюшинно инокулировали 10 ⁶ БОЕ вируса Менго в 250 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), а трех мышей оставили без лечения. Через четыре дня после заражения мышей умерщвляли и перфузировали PBS перед забором органов.

Векторы экспрессии

Кодирующая область мышиного гена Ifne была клонирована в векторе экспрессии pcDNA3 ниже промотора CMV, как это было ранее сделано для мышиного IFN-αA и IFN-β [7,16].Были созданы дополнительные конструкции, кодирующие IFN с меткой FLAG на С-конце. В последних конструкциях последовательность FLAG отделена от последней аминокислоты IFN с помощью линкера из трех аминокислот (рис. 1). Плазмиды, кодирующие IFN, меченные FLAG, были получены из pAGE1, производного pcDNA3, где последовательность, кодирующая эпитоп FLAG, оканчивающаяся стоп-кодоном, была клонирована между сайтами Not I и Xba I на 3′-конце сайта мультиклонирования вектора. . Последовательность, клонированная между Not I и Xba I, представляет собой 5′-GCG GCC GCA GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG TGA ATC TAG A.Этот вектор обеспечивает экспрессию белков, меченных FLAG на С-конце. Лентивирусные векторы были получены из pCCLsin. PPT. hPGK. GFP.pre (любезно предоставлен Луиджи Налдини, Ospedale San Raffaele, Милан, Италия) [19]. pTM945 был получен путем вставки в основу этого вектора: промотора цитомегаловируса, сайта мультиклонирования, IRES из TMEV [20] и кодирующей последовательности mCherry. ORF мышиного IFNαA и IFN-ε затем субклонировали в этой плазмиде с использованием сайтов рестрикции Sal I / Xba I и Bam HI / Xba I соответственно.Векторы экспрессии, использованные в этом исследовании, представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Плазмидные конструкции.

A. Производные pcDNA3, экспрессирующие IFN с меткой FLAG или без нее. В этих плазмидах кодирующие области (рамки) IFN клонированы ниже промотора цитомегаловируса (pCMV). Показаны сайты рестрикции, используемые для клонирования рамок считывания IFN. Кодирующие последовательности метки FLAG добавляли после последнего кодона IFN, как указано в C. IFN-αA (Δsp) и IFN-ε (Δsp) представляют собой конструкции, в которых область, кодирующая сигнальный пептид предшественника IFN, была удалена.lim-ε: химерный предшественник IFN с сигнальным пептидом лимитина и зрелым фрагментом IFN-ε. ε-lim представляет собой обратный химерный предшественник с сигнальным пептидом IFN-ε и зрелым фрагментом лимитина. Человеческий IFN-ε с сигнальным пептидом или без него обозначен как hIFN-ε и hIFN-ε (Δsp). Обратите внимание, что различные элементы на этих графических изображениях не масштабированы.

Б. Лентивирусные векторы. В этих векторах транскрипция гена IFN управляется промотором цитомегаловируса. Последовательность IRES из TMEV позволяет коэкспрессию клонированной кодирующей последовательности с красным флуоресцентным белком mCherry.

C. Последовательность соединений IFN-FLAG. X представляет собой последнюю аминокислоту IFN. Линкерная последовательность между IFN и FLAG (жирные буквы) представляет собой AAA для ε-lim и limitin и TAA для других конструкций.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071320.g001

Вестерн-блоттинг

Экстракты общего белка получали путем сбора и кипячения клеток в течение 5 минут в буфере Лэммли, через 24 часа после трансфекции или через 30 часов после трансфекции в случае обработки брефельдином А.Экспрессию IFN-FLAG анализировали вестерн-блоттингом с использованием гелей для электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), содержащих 15% акриламида. Блот исследовали моноклональным антителом против FLAG M2 (Sigma-Aldrich F3165).

Иммуномаркировка

Клетки фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) через 24 часа после трансфекции и пермеабилизировали в течение 5 минут 0,1% тритоном X-100. IFN, меченные FLAG, детектировали с использованием мышиного моноклонального антитела против FLAG (Sigma-Aldrich, F3165, используется при 1/1000) и вторичного антитела, меченного Alexafluor488 (Invitrogen, Life technologies ref A11029).Компартмент эндоплазматического ретикулума был идентифицирован путем котрансфекции pDsRed-ER [21]. Компартмент Гольджи идентифицировали после окрашивания гликозилированных белков агглютинином зародышей пшеницы, конъюгированным с Alexafluor 594 (WGA) (Molecular Probes, W11262).

Количественная RT-PCR

выделяли из органов, подвергали обратной транскрипции и подвергали количественной ОТ-ПЦР (RT-qPCR), как описано ранее [22], с использованием SybrGreen и аппарата MyIQ ^TM (Biorad). Последовательности праймеров: 5′-GCC GAA AGC CAC GTG TGT AA (смысл) и 5′-AGA TCC CAG CCA GTG GGG TA (антисмысловой) для вируса Менго, 5′-ATG AAC AAC AGG TGG ATC CTC C (смысл) и 5 ‘-AGG AGC TCC TGA CAT TTC CGA A (антисмысловой) для IFN-β, 5′-GGA TGC CTG GGA GAG AAT CG-3′ (смысл) и 5’-TCG CCT GCT CTT CGA AAC TG-3 ‘(антисмысловой ) для Oasl2 и 5′-CGG TGT TGC TGC TCT TGG TT (смысл), 5′-TCA CAG GCT GCT GAG GAA GC (антисмысловой) для IFN-ε и 5′-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3 ‘(смысл) и 5′-CAA TAG TGA TGA CCT GGC CGT-3’ (антисмысловой) для β-актина.Стандарты состояли из 10-кратных разведений известных концентраций плазмид, несущих соответствующие последовательности ДНК: pMC24 (вирус Менго), pcDNA3-IFN-β, pCS40 (Oasl2) pcDNA3-IFN-ε или pTM793 (β-актин).

Проточная цитометрия

Прилипшие клетки трипсинизировали и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере, содержащем 5% отфильтрованной фетальной сыворотки теленка и 1% параформальдегида. Сбор данных выполняли на анализаторе клеток LSR Fortessa (BD biosciences) с использованием программного обеспечения FACSDiva.Анализ проводился с помощью программного обеспечения FlowJo. Перед анализом на флуоресценцию GFP и mCherry клетки закрывали в соответствии с размером (прямое и боковое рассеяние).

Статистический анализ

Данные были проанализированы с помощью Prism версии 4.0c с использованием одностороннего критерия Манна – Уитни U . P Значения ≤ 0,05 считались значимыми.

Результаты

Экспрессия IFN-ε

Мы использовали количественный анализ ОТ-ПЦР, чтобы выяснить, может ли экспрессия Ifne быть усилена in vivo после вирусной инфекции.Поэтому уровни экспрессии мРНК генов, кодирующих IFN-β и IFN-ε, измеряли у мышей через 4 дня после внутрибрюшинной инокуляции вируса Менго. В головном, спинном мозге и сердце, органах, наиболее инфицированных этим вирусом, экспрессия Ifnb явно повышалась, а экспрессия Ifne — нет (рис. 2 A, B, C). Эти данные подтверждают, с другой моделью инфекции, отсутствие активации транскрипции Ifne вирусной инфекцией, что наблюдалось в предыдущих исследованиях [10,23].

Рисунок 2. Экспрессия IFN-ε in vivo.

А – С. Анализ RT-qPCR репликации вируса Mengo (A), экспрессии Ifnb (B) и экспрессии Ifne (C) в головном, спинном мозге и сердце мышей, инфицированных вирусом Mengo. Гистограммы показывают среднее значение ± стандартное отклонение копий кДНК вируса Менго на 10 ⁴ копий кДНК β-актина (n = 3). НД: не обнаружено. NS: незначительно.

D – E. Данные RT-qPCR, показывающие экспрессию Ifne в органах, взятых у неинфицированных самок (D) и самцов (E) мышей C57BL / 6.Каждый столбец относится к отдельному образцу и указывает количество копий кДНК Ifne на 10 ⁶ копий кДНК β-актина.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071320.g002

Поскольку вирусная инфекция не активировала Ifne , мы измерили экспрессию гена Ifne в различных тканях неинфицированных мышей самцов и самок. Результаты, представленные на рисунке 2D, показывают конститутивную экспрессию Ifne в матке и яичниках самок мышей, что согласуется с данными Fung et al.[10]. Кроме того, мы обнаружили более высокие уровни транскрипции Ifne в семенниках, чем в других органах мышей-самцов (рис. 2E). В соответствии с данными Fung et al., Мы обнаружили немного более высокую экспрессию Oasl2 , сильно индуцибельного IFN-стимулированного гена (ISG), в матке самок мышей, а также в яичниках (дополнительный рисунок S1). Уровни экспрессии Oasl2 в этих органах коррелировали с уровнями экспрессии Ifne , что позволяет предположить, что IFN-ε продуцируется локально.Мы также обнаружили более высокую экспрессию мРНК Oasl2 в кишечнике, хотя IFN-ε не экспрессировался в этом органе. Причина этого неизвестна. Это могло быть следствием гомеостатической экспрессии IFN, запускаемой микробиотой в этом органе [24].

В совокупности наши данные в значительной степени подтверждают недавнюю работу Fung et al. показывая, что IFN-ε не индуцируется вирусной инфекцией, но конститутивно экспрессируется в репродуктивных тканях, и распространить наблюдение на мужскую репродуктивную ткань [10].

Экспрессия IFN-ε трансфицированными клетками

Для оценки противовирусной активности IFN-ε клетки 293T трансфицировали экспрессионными плазмидами, кодирующими IFN-α, IFN-β, IFN-ε, или эквивалентными конструкциями, кодирующими IFN с C-концом, меченными FLAG. Супернатанты трансфицированных клеток, собранные через 24 и 48 часов после трансфекции, анализировали на противовирусную активность с использованием анализа снижения цитопатического эффекта. Противовирусная активность меченых и немаркированных IFN-α и IFN-β существенно не различалась (фиг. 3), что позволяет предположить, что C-концевой эпитоп FLAG не влияет ни на продукцию IFN, ни на связывание рецептора.Неожиданно было обнаружено незначительное противовирусное действие, если оно вообще было обнаружено в супернатанте клеток 293T, трансфицированных векторами, экспрессирующими меченый или немаркированный IFN-ε (фиг. 3). Аналогичные результаты наблюдались, когда плазмиды, экспрессирующие IFN, трансфицировали в клетки Neuro2A или BALB / 3T3, которые имеют мышиное происхождение. Мы пришли к выводу, что либо IFN-ε обладает небольшой противовирусной активностью, либо этот IFN не экспрессируется или не секретируется трансфецированными клетками.

Рисунок 3. Активность FLAG-меченых и немаркированных IFN мыши.

Гистограммы показывают логарифм ₂ противовирусных активностей, обнаруженных в супернатанте клеток Neuro2A, собранных через 24 часа после трансфекции производных pcDNA3, экспрессирующих указанные IFN, меченные FLAG (+) или немаркированные (-), или после трансфекции соответствующих пустых векторов. (pcDNA3). Противовирусная активность представлена ​​относительно активности питательной среды. NS: незначительно (критерий Манна – Уитни U ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071320.g003

Обработка прекурсора IFN

использовали для обнаружения меченных FLAG IFN-ε и IFN-αA в клетках Neuro2A, трансфицированных векторами экспрессии. Клетки либо обрабатывали, либо имитировали в течение 6 часов брефельдином А перед экстракцией белка, чтобы вызвать задержку секретируемых белков. Как показано на фиг. 4A, FLAG-IFN-ε легко обнаруживался в экстрактах трансфицированных клеток. Удивительно, но в отличие от IFN-αA, который мигрировал с ожидаемой кажущейся молекулярной массой (19 кДа) и накапливался после обработки брефельдином A (фиг. 4A, дорожки 1 и 2), IFN-ε проявлялся как основная полоса, мигрирующая медленнее, чем ожидалось ( 22 кДа), на количество которых не влияла обработка брефельдином А.Небольшая полоса, мигрирующая с ожидаемой скоростью (20 кДа), появилась после обработки брефельдином А (фиг. 4A, дорожки 3 и 4). Эти данные свидетельствуют о том, что предшественник IFN-ε не обрабатывается должным образом в трансфицированных клетках. Мы подтвердили, что минорная полоса, обнаруженная для IFN-ε, и основная полоса, обнаруженная для IFN-αA, имели молекулярные массы, совместимые со зрелыми формами этих IFN, путем сравнения их профилей миграции с профилями соответствующих IFN, экспрессируемых без сигнальной последовательности (рис. 4B).

Рисунок 4.Обработка предшественника IFN-ε в трансфицированных клетках.

Вестерн-блот-анализ процессинга IFN-α и IFN-ε в экстрактах общего белка клеток Neuro2A, трансфицированных в течение 24 часов производными pcDNA3, экспрессирующими IFN, меченные FLAG.

A. Обнаружение мышиного IFN-α и IFN-ε в присутствии или в отсутствие брефельдина A. Стрелки указывают на две полосы, обнаруженные при обнаружении IFN-ε. Β-актина, использовали в качестве контроля нагрузки. B. Обнаружение мышиных IFN-α и IFN-ε вместе с соответствующими белками, экспрессируемыми без сигнального пептида (Δsp).C. Определение человеческого IFN-ε и мышиного IFN-β в клетках 293T до и после обработки N-гликозидазой F.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071320.g004

Интересно, что обработка человеческого IFN-ε также была аномальной (рис. 4C). В отличие от мышиного IFN-ε, человеческий IFN-ε несет два предполагаемых сайта N-гликозилирования [13]. В экстрактах из трансфицированных клеток 293T человеческий IFN-ε, меченный FLAG, был обнаружен в виде двух полос (фиг. 4C, дорожка 3). Ни одна из двух полос не соответствовала N-гликозилированному IFN, поскольку обработка N-гликозидазой F не изменяла характер миграции (фиг. 4C, дорожка 4).Верхняя полоса, вероятно, соответствовала предшественнику IFN-ε. Нижняя полоса мигрировала со скоростью, близкой к скорости IFN-ε, экспрессируемой без сигнальной последовательности (рис. 4C, дорожка 5). Однако тот факт, что в этой форме IFN-ε отсутствует N-гликозилирование, указывает на то, что этот IFN, возможно, не достиг секреторного пути. Мышиный IFN-β с меткой FLAG, взятый в качестве контроля в этом эксперименте, мигрировал в виде множества полос (фиг. 4C, дорожка 1), как и ожидалось, исходя из того факта, что этот подтип IFN несет три сайта N-гликозилирования [25].После обработки N-гликозидазой F FLAG-IFN-β преобладающая полоса появилась с ожидаемой молекулярной массой для зрелого белка (фиг. 4C, дорожка 2). Эти результаты показывают, что обработка сигнальной последовательности IFN-ε очень неэффективна в клетках, трансфицированных плазмидами экспрессии. В соответствии с приведенными выше данными, предсказание присутствия сигнального пептида сервером Signal P 4.1 [26] было плохим для мышиных и человеческих предшественников IFN-ε, в отличие от других мышиных предшественников IFN типа I (Таблица 1).

Таблица 1. Прогнозирование сигнального пептида (сервер Signal P 4.1).

Таким образом, мы спросили, является ли этот неэффективный процессинг предшественника IFN-ε следствием последовательности сигнального пептида. Лимитин, также называемый IFN-ζ, представляет собой IFN типа I, проявляющий противовирусную активность [27].Было показано, что этот подтип IFN эффективно секретируется клетками 293T, трансфицированными экспрессионной плазмидой [7]. Тем не менее, аминокислотная последовательность вокруг предсказанного сайта расщепления предшественника лимитина [28] близка к предсказанной для IFN-ε (Рисунок 5A).

Рис. 5. Сигнальный пептид IFN-ε не является полностью функциональным.

A. Сигнальные пептиды, предсказанные для IFN-ε и лимитина. Прогнозируемые сигнальные пептиды выделены жирным шрифтом. Связанные аминокислоты вокруг предполагаемого сайта расщепления заключены в рамку.

B. Вестерн-блоттинг-анализ клеточных лизатов из клеток Neuro2A, которые были трансфицированы в течение 24 часов производными pcDNA3, экспрессирующими FLAG-меченный IFN-ε, IFN-ε (Δsp), lim-ε, ε-lim или лимитин. Клетки собирали в буфере Лэммли через двадцать четыре часа после трансфекции.

C. Гистограммы, показывающие для указанных конструкций долю клеток, в которых IFN колокализуется в основном с Golgi или с эндоплазматическим ретикулумом. Средства и SD отсчетов из 4-х иммуноокрашиваний. Для каждого подсчета n = ± 200 для IFN-α, lim-ε, limitin и ε-lim; n = 100 для IFN-ε.

D. Иммунофлуоресцентное обнаружение IFN, меченных FLAG, в клетках HeLa, трансфицированных плазмидами, экспрессирующими указанные меченые IFN. IFN отображаются зеленым цветом. Лектин WGA использовали для обнаружения гликозилированных белков и выделения сети Гольджи (красный).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071320.g005

Чтобы проверить влияние сигнального пептида на процессинг и секрецию IFN, мы сконструировали химерные плазмиды путем обмена последовательностями, кодирующими сигнальный пептид, лимитина и IFN-ε. в конструкциях с тегами FLAG (рис. 1).Эти конструкции трансфицировали вместе с контрольными плазмидами в клетки Neuro2A. Как показано на фиг. 5B, замена сигнального пептида IFN-ε на пептид лимитина улучшила процессинг IFN-ε (фиг. 5B, сравните дорожки 1 и 3). И наоборот, когда сигнальный пептид лимитина был заменен пептидом IFN-ε, на вестерн-блотах появилась полоса, совместимая с незрелым лимитином (фиг. 5B, сравните дорожки 5 и 4). Такие же результаты наблюдались в клетках 293T и HeLa (данные не показаны). Эти данные предполагают, что как сигнальная последовательность, так и зрелая часть IFN-ε способствуют плохому процессингу предшественника.

Прогрессирование IFN по секреторному пути

Затем мы использовали иммунофлуоресцентное мечение IFN, меченных FLAG, в трансфицированных клетках, чтобы проверить, коррелирует ли плохой процессинг сигнального пептида с измененным прогрессированием IFN в секреторном пути. Следовательно, плазмиды, кодирующие IFN-α, IFN-ε, lim-ε, ε-lim и лимитин с меткой FLAG, временно экспрессировались в клетках HeLa. Клетки наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии в слепом эксперименте. Подсчет проводился в соответствии с основной локализацией IFN либо в компартменте Гольджи, либо в эндоплазматическом ретикулуме (рис. 5C).В то время как IFN-αA и лимитин в основном обнаруживались в компартменте Гольджи, IFN-ε обнаруживал более диффузную локализацию в клетках, частично совмещая с эндоплазматическим ретикулумом (ER) и частично показывая более диффузный цитоплазматический паттерн (Рисунок 5D). Только несколько клеток показали IFN-ε, связанный с компартментом Гольджи. Примечательно, что обнаружение IFN-ε было намного слабее, чем обнаружение других IFN, что позволяет предположить, что часть экспрессированного IFN-ε деградировала в клетках. Замена сигнального пептида IFN-ε на пептид лимитина значительно увеличила обнаружение химерного белка в компартменте Гольджи (односторонний тест Манна-Уитни, p = 0.0143). Замена зрелого фрагмента IFN-ε на фрагмент лимитина также увеличивала нацеливание химерного белка на компартмент Гольджи (односторонний тест Манна-Уитни, p = 0,0143). Эти данные подтверждают, что как сигнальная последовательность, так и зрелая часть IFN-ε способствуют плохому процессингу белка-предшественника и, следовательно, предотвращают доступ IFN-ε к секреторному пути. Аналогичные результаты были получены на эмбриональных фибробластах мыши C57BL / 6 (дополнительная фигура S2).

Внутриклеточная активность IFN-ε

Поскольку IFN-ε секретируется клетками неэффективно, мы затем спросили, может ли IFN-ε обеспечивать вирусную защиту продуцирующим клеткам в отсутствие секреции.Поэтому мы трансдуцировали клетки лентивирусными бицистронными векторами, позволяющими коэкспрессию флуоресцентного белка mCherry и мышиного IFN-α (pPH50) или IFN-ε (pPh59), или пустым вектором, экспрессирующим только mCherry (pTM945) (рис. ). Через три дня после трансдукции антивирусное состояние трансдуцированных клеточных популяций анализировали с помощью FACS после заражения KJ07, производным вируса энцефаломиелита мышей Тейлера, экспрессирующим eGFP. В этом случае была обнаружена противовирусная активность IFN-ε, но она была низкой по сравнению с IFN-αA.Для клеток, трансдуцированных с аналогичной эффективностью, процент инфицированных клеток составлял 10,84 ± 0,61% для клеток, экспрессирующих IFN-ε, и 1,56 ± 0,24% для клеток, экспрессирующих IFN-αA (фиг. 6). Интересно, что клетки, экспрессирующие IFN-ε, по данным флуоресценции mCherry, были не более защищены от вирусной инфекции, чем нетрансдуцированные mCherry-отрицательные клетки той же популяции (уровни инфицирования составляли 13,62% в клетках, экспрессирующих IFN-ε, и 10,43% в IFN-ε. отрицательные клетки). Таким образом, внутриклеточная экспрессия IFN-ε не вызывала устойчивости к вирусной инфекции.

Рис. 6. IFN-ε не действует внутриклеточно.

FACS-анализ клеток, трансдуцированных в течение 4 дней бицистронными лентивирусными конструкциями, коэкспрессирующими mCherry и указанный IFN. pTM945 представляет собой пустой вектор, экспрессирующий только mCherry.

A. Репрезентативная точечная диаграмма FACS.

B. Таблица, показывающая среднее значение и стандартное отклонение процента инфицированных клеток в общей популяции клеток (данные из 3 экспериментов по заражению).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0071320.g006

Обсуждение

Наши данные подтверждают необычные особенности гена Ifne , то есть то, что этот ген не подвергается транскрипционной активации после вирусной инфекции и что он конститутивно экспрессируется клетками женского репродуктивного тракта. Наши данные распространяют эти наблюдения на клетки мужского репродуктивного тракта. Недавно Fung et al. [10] продемонстрировали, что, в отличие от других IFN типа I, IFN-ε регулируется гормонально. Действительно, экспрессия мыши Ifne повышалась после введения эстрогена.Соответственно, экспрессия человеческого IFNE в эпителиальных клетках, выделенных из эндометрия матки, была выше в пролиферативной фазе, когда уровни эстрогена самые высокие [10]. Более того, сайты связывания рецепторов прогестерона были идентифицированы в промоторах как мышиных, так и человеческих генов IFN-ε [6]. Таким образом, регуляция экспрессии IFN-ε разительно отличается от регуляции других IFN типа I.

IFN типа I секретируются большинством типов клеток и проявляют свою противовирусную активность в отношении соседних клеток.Удивительно, но мы практически не обнаружили противовирусной активности в супернатанте клеток, трансфицированных векторами, экспрессирующими IFN-ε. Это побудило нас исследовать, секретируется ли этот IFN этими клетками. Интересно, что предшественники IFN-ε мыши и человека неэффективно процессировались в клетках, трансфицированных векторами экспрессии, и секреция IFN-ε была минимальной. Анализ химерных конструкций, полученных между IFN-ε и лимитином (IFN-ζ), показал, что как сигнальный пептид, так и зрелая часть IFN-ε вносят вклад в плохой процессинг предшественника.Иммунофлуоресцентное обнаружение FLAG-меченного IFN-ε в трансфицированных клетках HeLa или эмбриональных фибробластах мыши позволило предположить, что прогрессирование IFN-ε по секреторному пути было ограничено, поскольку белок редко обнаруживался в аппарате Гольджи.

Учитывая конститутивную экспрессию IFN-ε в специализированных клетках и плохую обработку предшественника IFN-ε в тестируемых клеточных линиях, мы предполагаем, что для секреции IFN-ε может потребоваться кофактор, такой как шаперон, специфически экспрессируемый в клетках репродуктивные органы.С одной стороны, требование определенного кофактора могло бы защитить систему от утечки IFN-ε в других тканях. С другой стороны, определенный кофактор может регулировать секрецию IFN-ε в ответ на триггеры окружающей среды, такие как гормоны или цитокины. Для подтверждения этой гипотезы потребуются дальнейшие эксперименты.

В заключение, наше исследование подчеркивает необычный паттерн экспрессии и ограничение секреции члена семейства IFN типа I: IFN-ε.Мы демонстрируем, что этот IFN плохо секретируется после трансфекции вектора экспрессии в различные клеточные линии. Поскольку этот IFN конститутивно экспрессируется в клетках женских и мужских репродуктивных трактов, мы предполагаем, что секреция IFN-ε может регулироваться специфическим фактором, экспрессируемым в этих клетках.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Уровень экспрессии Oasl2 повышен в матке и яичниках. Данные RT-qPCR, показывающие экспрессию Oasl2 в органах, собранных у неинфицированных самок мышей C57BL / 6 (такие же, как на фиг. 2A).Каждый столбец относится к отдельному образцу и указывает количество копий кДНК Oasl2 на 10 ² копий кДНК β-актина.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071320.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Плохая прогрессия IFN-ε через секреторный путь трансфицированных MEF / T. А. Иммунофлуоресцентное обнаружение IFN, меченных FLAG, в MEF / T-клетках, трансфицированных плазмидами, экспрессирующими указанные меченые IFN. Б.Гистограммы, показывающие для указанных конструкций долю клеток, в которых IFN колокализуется в основном с Golgi (темно-серый) или с эндоплазматическим ретикулумом (светло-серый). Под каждым графиком указано количество подсчитанных клеток.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071320.s002

(TIF)

Благодарности

Мы благодарны Мюриэль Минет за экспертную техническую помощь и Николя Доге (Институт исследования рака Людвига, Брюссель) за помощь в проточной цитометрии.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: PH CF FC TM. Проведены эксперименты: PH TM. Проанализированы данные: PH TM. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: PH CF FC TM. Написал рукопись: PH TM.

Ссылки

1. 1. Айзекс А., Линденманн Дж. (1957) Вмешательство вируса. I. Интерферон Proc R Soc Lond B Biol Sci 147: 258-267. DOI: https: //doi.org/10.1098/rspb.1957.0048.
2. 2. Uzé G, Schreiber G, Piehler J, Pellegrini S (2007) Рецептор семейства интерферонов типа I.Curr Top Microbiol Immunol 316: 71-95. DOI: https: //doi.org/10.1007/978-3-540-71329-6_5. PubMed: 17969444.
3. 3. Liu SY, Sanchez DJ, Cheng G (2011) Новые разработки в области индукционных и противовирусных эффекторов интерферона типа I. Curr Opin Immunol 23: 57-64. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.coi.2010.11.003. PubMed: 21123041.
4. 4. Randall RE, Goodbourn S (2008) Интерфероны и вирусы: взаимодействие между индукцией, сигнализацией, противовирусными реакциями и мерами противодействия вирусам.Дж. Ген Вирол 89: 1-47. DOI: https: //doi.org/10.1099/vir.0.83391-0. PubMed: 18089727.
5. 5. Schoggins JW, Wilson SJ, Panis M, Murphy MY, Jones CT et al. (2011) Различные генные продукты являются эффекторами противовирусного ответа интерферона типа I. Nature 472: 481-485. DOI: https: //doi.org/10.1038/nature09907. PubMed: 21478870.
6. 6. Hardy MP, Owczarek CM, Jermiin LS, Ejdebäck M, Hertzog PJ (2004) Характеристика локуса интерферона типа I и идентификация новых генов.Геномика 84: 331-345. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.ygeno.2004.03.003. PubMed: 15233997.
7. 7. van Pesch V, Lanaya H, Renauld JC, Michiels T (2004) Характеристика семейства генов альфа-интерферона мыши. Дж. Вирол 78: 8219-8228. DOI: https: //doi.org/10.1128/JVI.78.15.8219-8228.2004. PubMed: 15254193.
8. 8. Manry J, Laval G, Patin E, Fornarino S, Itan Y et al. (2011) Эволюционное генетическое вскрытие интерферонов человека. J Exp Med 208: 2747-2759. doi: https: // doi.org / 10.1084 / jem.20111680. PubMed: 22162829.
9. 9. Sang Y, Rowland RR, Hesse RA, Blecha F (2010) Дифференциальная экспрессия и активность семейства интерферонов свиного типа I. Physiol Genomics 42: 248-258. DOI: https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00198.2009. PubMed: 20406849.
10. 10. Fung KY, Mangan NE, Cumming H, Horvat JC, Mayall JR et al. (2013) Интерферон-эпсилон защищает женские половые пути от вирусных и бактериальных инфекций. Наука 339: 1088-1092.DOI: https: //doi.org/10.1126/science.1233321. PubMed: 23449591.
11. 11. Хуанг Дж., Смирнов С.В., Льюис-Антеш А., Балан М., Ли В. и др. (2007) Ингибирование интерферонов типа I и типа III секретируемым гликопротеином вируса болезни Яба. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 9822-9827. DOI: https: //doi.org/10.1073/pnas.0610352104. PubMed: 17517620.
12. 12. Day SL, Ramshaw IA, Ramsay AJ, Ranasinghe C (2008) Дифференциальные эффекты интерферонов типа I альфа4, бета и эпсилон на противовирусную активность и эффективность вакцины.Дж. Иммунол 180: 7158-7166. PubMed: 184.
13. 13. Пэн Ф.В., Дуан З.Дж., Чжэн Л.С., Се З.П., Гао Х.С. и др. (2007) Очистка рекомбинантного человеческого интерферона-эпсилон и анализ олигонуклеотидных микрочипов генов, регулируемых интерферон-эпсилон. Protein Expr Purif 53: 356-362. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.pep.2006.12.013. PubMed: 17287131.
14. 14. DuBridge RB, Tang P, Hsia HC, Leong PM, Miller JH et al. (1987) Анализ мутации в клетках человека с использованием системы челнока вируса Эпштейна-Барра.Mol Cell Biol 7: 379-387. PubMed: 3031469.
,
15. , 15. Aaronson SA, Todaro GJ (1968) Развитие 3T3-подобных линий из культур эмбрионов мышей Balb-c: чувствительность к трансформации к SV40. J. Cell Physiol 72: 141-148. DOI: https://doi.org/10.1002/jcp.1040720208. PubMed: 4301006.
16. 16. van Pesch V, Michiels T (2003) Характеристика интерферона-альфа 13, нового конститутивного подтипа мышиного интерферона-альфа. J Biol Chem 278: 46321-46328. doi: https: //doi.org/10.1074 / jbc.M302554200. PubMed: 12930842.
17. 17. Michiels T, Dejong V, Rodrigus R, Shaw-Jackson C (1997). Белок 2A не требуется для репликации вируса Тейлера. Дж. Вирол 71: 9549-9556. PubMed: 9371618.
18. 18. Duke GM, Osorio JE, Palmenberg AC (1990) Аттенуация вируса Менго посредством генной инженерии 5′-некодирующего поли (C) тракта. Nature 343: 474-476. DOI: https: //doi.org/10.1038/343474a0. PubMed: 2153940.
19. 19. Follenzi A, Ailles LE, Bakovic S, Geuna M, Naldini L (2000) Перенос генов лентивирусными векторами ограничивается ядерной транслокацией и спасается последовательностями pol ВИЧ-1.Нат Генет 25: 217-222. DOI: https: //doi.org/10.1038/76095. PubMed: 10835641.
20. 20. Shaw-Jackson C, Michiels T (1999) Отсутствие тканевой специфичности, опосредованной внутренним сайтом входа в рибосомы, при трансляции бицистронного трансгена. J Virol 73: 2729-2738. PubMed: 10074119.
21. 21. Roderick HL, Campbell AK, Llewellyn DH (1997) Ядерная локализация кальретикулина in vivo усиливается за счет его взаимодействия с рецепторами глюкокортикоидов. FEBS Lett 405: 181-185.DOI: https: //doi.org/10.1016/S0014-5793 (97) 00183-X. PubMed: 87.
22. 22. Paul S, Michiels T (2006) Лидирующие белки кардиовирусов функционально взаимозаменяемы и эволюционировали, чтобы адаптироваться к репликации вирусов. J Gen Virol 87: 1237-1246. DOI: https: //doi.org/10.1099/vir.0.81642-0. PubMed: 16603526.
23. 23. Delhaye S, Paul S, Blakqori G, Minet M, Weber F et al. (2006) Нейроны продуцируют интерферон I типа во время вирусного энцефалита. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 7835-7840.DOI: https: //doi.org/10.1073/pnas.0602460103. PubMed: 16682623.
24. 24. Ganal SC, Sanos SL, Kallfass C, Oberle K, Johner C и др. (2012) Примирование естественных клеток-киллеров неслизистыми мононуклеарными фагоцитами требует инструктивных сигналов от комменсальной микробиоты. Иммунитет 37: 171-186. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.immuni.2012.05.020. PubMed: 22749822.
25. 25. Sommereyns C, Michiels T (2006) N-гликозилирование мышиного IFN-бета в предполагаемой рецептор-связывающей области.J. Интерферон цитокин Res 26: 406-413. DOI: https: //doi.org/10.1089/jir.2006.26.406. PubMed: 16734561.
26. 26. Петерсен TN, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H (2011) SignalP 4.0: различение сигнальных пептидов из трансмембранных областей. Nat Методы 8: 785-786. DOI: https: //doi.org/10.1038/nmeth.1701. PubMed: 21959131.
27. 27. Кавамото С., Оритани К., Асада Х., Такахаши И., Исикава Дж. И др. (2003) Противовирусная активность лимитина против вируса энцефаломиокардита, вируса простого герпеса и вируса гепатита мышей: различные требования лимитина и альфа-интерферона для фактора регуляции интерферона 1.Дж. Вирол 77: 9622-9631. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.77.17.9622-9631.2003. PubMed: 124.
28. 28. Oritani K, Kincade PW, Zhang C, Tomiyama Y, Matsuzawa Y (2001) Интерфероны I типа и лимитин: сравнение структур, рецепторов и функций. Фактор роста цитокинов Rev 12: 337-348. DOI: https: //doi.org/10.1016/S1359-6101 (01) 00009-0. PubMed: 11544103.

границ | IFN-Lambda 3 опосредует противовирусную защиту от вируса эпидемической диареи свиней, индуцируя отчетливый профиль антивирусных транскриптов в эпителии кишечника свиней

Введение

Поверхностный эпителий слизистой оболочки является основным местом проникновения большинства патогенов в организм хозяина и служит первой линией защиты от вторжения патогенов.Одним из наиболее важных противовирусных цитокинов в организме хозяина являются интерфероны (IFN), которые играют ключевую роль в подавлении вирусной инфекции (1, 2). Семейство IFN подразделяется на три различных типа: IFN типа I (IFN-α / β), IFN типа II (IFN-γ) и IFN типа III (IFN-λ). IFN типа II, который в основном продуцируется Т-клетками и естественными клетками-киллерами, оказывает ограниченное прямое противовирусное действие и играет ключевую роль в модуляции иммунного ответа хозяина (3), тогда как IFN типа I (α / β) и недавно обнаруженные IFN типа III вызывают сильное противовирусное состояние в чувствительных клетках и играют решающую роль в контроле вирусной инфекции (4-8).Хотя обычно считается, что IFN типа I являются ключевым элементом против системных инфекций, недавние исследования показали, что IFN-λ играет критическую роль в инфекциях слизистых оболочек, таких как кишечная инфекция (9, 10). В отличие от IFN типа I, которые секретируются широким спектром различных типов клеток при стимуляции, IFN типа III в основном продуцируются эпителиальными клетками, NK-клетками и дендритными клетками (DC) (8, 11-13). IFN-λ действует в основном на эпителий слизистой оболочки, что может приводить к меньшему количеству побочных эффектов по сравнению с лечением IFN типа I (8).Эти особенности делают IFN-λ потенциально лучшим противовирусным терапевтическим кандидатом против местной инфекции слизистой оболочки (7).

Хотя рецепторы для IFN типов I и III различаются, связывание IFN типов I и III с их соответствующими рецепторами стимулирует сигнальный преобразователь транскрипции (STAT) к киназе Януса (JAK), а затем и стимуляцию этого пути. управляет транскрипцией IFN-стимулированных генов (ISG) и подталкивает клетки к антивирусному статусу (14).В соответствии со сходством индуцированных сигнальных путей, спектр генов, индуцируемых двумя типами IFNs, сильно перекрывается (2). Однако недавние исследования показали, что IFN типа III являются критическими неизбыточными противовирусными медиаторами IFNs типа I в желудочно-кишечном тракте (2). На сегодняшний день многочисленные исследования на людях или мышах использовали преимущества RNA-Seq или анализа с помощью чипов, чтобы показать, что IFN-λ и IFN-α вызывают различные нижестоящие сигнальные события, хотя многие гены индуцируются как IFN типа I, так и III (15 , 16).Мыши с нокаутом рецептора IFN типа I или III испытывают более тяжелые вирусные кишечные инфекции, но мыши Ifnl ^{— / —} демонстрируют более высокую вирусную нагрузку и более серьезные клинические симптомы, чем мыши IFNAR ^{— / —} (17, 18). Исследования, проведенные Pott et al. показали, что эпителиальные клетки кишечника проявляют более сильный ответ на IFN-λ по сравнению с IFN-α / β in vivo (19, 20). Всестороннее понимание уникальных сигнальных профилей IFN типов I и III становится все более важным для понимания взаимодействий хозяин-вирус и разработки терапевтических средств IFN-λ.Однако до сих пор не проводилось прямого сравнительного анализа профилей транскрипции, индуцированных IFN типа I свиньи по сравнению с IFN типа III в эпителии кишечника свиней.

Диарея поросят, вызванная кишечным коронавирусом Вирус эпидемической диареи свиней (PEDV), представляет собой высококонтагиозное заболевание, характеризующееся водянистой диареей, обезвоживанием и вызывающим до 100% смертности новорожденных поросят. Мы и другие исследовательские группы ранее сообщали, что свиной IFN-λ приводит к лучшему подавлению инфекции PEDV по сравнению с IFN-α и что IFN-λ3 более эффективно ингибирует PEDV, чем IFN-λ1 (21–23).Однако механизмы, лежащие в основе различий между IFN-λ1, IFN-λ3 и IFN-α в ингибировании кишечного коронавируса, остаются менее ясными. Предыдущие исследования в основном были сосредоточены на профилях генов, индуцированных IFN-λ1 и IFN-α человека или мыши, но гены, вызванные IFN-λ3- и IFN-α, не сравнивались. В этом исследовании мы всесторонне сравнили профили транскрипции IFN-λ3- и IFN-α-индуцированных генов в линии эпителиальных клеток кишечника свиней (IPEC-J2) и проверили результаты RNA-Seq с помощью количественной ПЦР с обратной транскриптазой (RT-qPCR). ) in vitro , и дополнительно подтвердили различие в профиле транскрипции в энтероидах свиней, полученных из крипт.

Материалы и методы

Клетки и вирусы

Линия эпителиальных клеток кишечника свиней J2 (IPEC-J2; любезно предоставлена ​​доктором Энтони Бликслагером, Университет штата Северная Каролина, Роли, Северная Каролина, США) поддерживалась в модифицированной смеси питательных веществ Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) с добавлением с антибиотиками (100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина), 0,1 мМ HEPES (Gibco, США) и 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Gibco). Клетки почек африканской зеленой мартышки (Vero E6) выращивали и поддерживали в среде DMEM с добавлением антибиотиков (100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) и 10% инактивированного нагреванием FBS (Gibco).Штамм PEDV CV777 генотипа 1 (номер доступа в GenBank KT323979) содержался в Харбинском институте ветеринарных исследований Китайской академии сельскохозяйственных наук, Харбин.

Определение противовирусных единиц (AU) IFN-λ3

Биологическая противовирусная активность рекомбинантного свиного IFN-лямбда 3, полученного из E. coli , была получена в нашей лаборатории и оценена на клетках MDBK с использованием рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (VSV) с репортером GFP, как описано ранее (22, 24) .Единица массы-активности (Ед / мл) образцов рассчитывалась с использованием свиного прокариотического происхождения IFN-α (4,0 × 10 ⁸ Ед / мг) (Prosit Sole Biotechnology, Co., Ltd., Пекин, Китай) в качестве ссылка.

Культура кишечных энтероидов свиней и среды

Крипты кишечника свиней получали из определенных свободных от патогенов поросят с использованием ранее описанных протоколов (21). Вкратце, кишечник промывали холодным PBS с антибиотиками (100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина), разрезали на 2-миллиметровые сегменты и промывали холодным PBS с антибиотиками до тех пор, пока супернатант не стал прозрачным.Промытые кусочки кишечника суспендировали в 15 мл реагента для нежной диссоциации клеток (STEMCELL, Канада) и встряхивали при 100 об / мин в течение 25 минут для диссоциации крипт при комнатной температуре (RT). Осадки кусочков кишечника суспендировали в 10 мл холодного PBS с 0,1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) и антибиотиками (Pen-Strep) и пропускали через ячейку с ячейками размером 70 мкм. Осадки крипт собирали центрифугированием при 200 × g при 4 ° C в течение 5 минут и ресуспендировали в 10 мл холодного DMEM / F12.После подсчета кишечные крипты ресуспендировали в 25 мкл среды для выращивания органоидов IntestiCult (STEMCELL, Канада) и 25 мкл Matrigel (BD Biosciences, США) на 50 крипт и высевали в 48-луночный планшет по 50 крипт на лунку. Планшет инкубировали при 37 ° C в течение 10 мин до затвердевания матригеля. Планшет заполняли питательной средой Complete IntestiCult для органоидов и затем инкубировали при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO ₂ . Среду культивирования меняли каждые 3–4 дня. Институциональный комитет по уходу и использованию животных Харбинского ветеринарного научно-исследовательского института одобрил все протоколы, относящиеся к экспериментам на животных, проведенным в этом исследовании.

Двумерная (2D) однослойная энтероидная культура

Расширенные 3D энтероиды были извлечены из матригеля через 7-11 дней роста путем добавления ледяной среды DMEM / F12, перенесены в 15-мл пробирки и центрифугированы при 250 × g при 4 ° C в течение 5 мин. . Осадок энтероидов инкубировали в 0,25% трипсине (Gibco) в течение 5 минут при 37 ° C и диссоциировали повторным пипетированием с получением суспензии одноклеточных. DMEM-F12 с 10% (об. / Об.) FBS добавляли в суспензию отдельных клеток и смесь центрифугировали при 800 × g в течение 5 мин.Осадки клеток ресуспендировали в полной среде для роста органоидов IntestiCult при комнатной температуре и высевали по 50 энтероидов на лунку в 96-луночный планшет с предварительно нанесенным матригелем. После дифференцировки в течение 3-4 дней планарные монослои 2D энтероидов были готовы к использованию в экспериментах.

Выделение РНК и ОТ-КПЦР